輸入性蚤類病原體檢測規(guī)程

中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準輸入性蚤類病原體檢測規(guī)程Detectingcodesforimported2005-02-17發(fā)布2005-02-17發(fā)布中，華人民共、和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局輸入性蚤類病原體檢測規(guī)程——酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)參見第B.3章。6.4分子生物學(xué)檢驗聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測鼠疫菌F1抗原基因技術(shù)參見第B.4章。6.5結(jié)果報告6.5.1細菌學(xué)檢驗結(jié)果報告經(jīng)鼠疫細菌學(xué)四項檢查，如符合鼠疫菌的特點，可判定為鼠疫菌，作出初步報告：“檢出鼠疫菌”。判定標準見A.2.5。并及時上報主管部門。6.5.2血清學(xué)與分子生物學(xué)結(jié)果報告6.5.2.1血清學(xué)陰性結(jié)果報告“鼠疫菌F1抗原檢測陰性”,注明檢驗方法；陽性結(jié)果，應(yīng)用兩種以上血清學(xué)方法復(fù)試，陽性結(jié)果報告“鼠疫菌F1抗原檢測陽性”,注明檢驗方法。6.5.2.2聚合酶鏈反應(yīng)陽性的結(jié)果報告“鼠疫菌F1基因片段檢測陽性”,注明檢測方法。6.5.2.3血清學(xué)和聚合降鏈反應(yīng)陽性的檢材應(yīng)作鼠疫細菌學(xué)培養(yǎng)，獲得鼠疫菌株按6.5.1報告。6.6菌株的復(fù)判和保存6.6.1陽性檢材和菌林應(yīng)送具有資質(zhì)的實驗室復(fù)判。6.6.2經(jīng)鑒定確認的鼠疫菌株應(yīng)由具有資質(zhì)的實驗室保存。6.6.3原檢出單位所保存的陽性檢材和菌株，待復(fù)判結(jié)果后，在主管部門的監(jiān)督下銷毀。7類莫氏立克次體的檢測程序7.1涂片鏡檢方法與結(jié)果判斷參見第C.1章。7.2莫氏立克次體的分離7.2.1可采用以下動物或組織細胞分離莫氏立克次體；—雄性豚鼠(體重250g~300g);——雞胚卵黃囊(5d~7d);7.2.2材料處理及分離方法參見第C.2章。7.3菌株鑒定7.3.1免疫熒光試驗、用莫氏立克次體特異性單克隆抗體鑒定分離株見WS215。7.3.2微量補體結(jié)合試驗用已知莫氏立克次體標準血清鑒定分離株見WS215。7.3.3多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)參見第C,3章。7.4結(jié)果報告7.4.1根據(jù)檢測結(jié)果作出相應(yīng)報告并注明檢驗方法。7.4.2陽性結(jié)果及時上報主管部門。(規(guī)范性附錄)鼠疫組菌學(xué)檢查方法A.1蚤類材料的采集和處理在檢蛋室，打開限袋，將鼠放入大白搪瓷盆內(nèi)檢蛋，可用小疑子道宿主的皮毛翻檢，或以菌梳梳刷皮毛上的蛋。切忌用藥劑熏殺。收集的鼠體蛋，分類后裝入含有0.5×10°龍膽紫，2%鹽水的小瓶內(nèi)，注明寄主、采集地點、采集A.1.3集組檢驗檢獲大量量時，可按同來源、同宿主、同量種進行分組檢驗，每組15匹～30匹為一組，用1×10-°的龍膽紫生理鹽水洗凈后在乳缽中研磨，每組孟加入1mL～2mL滅菌生理鹽水制成懸液備檢。A.1.4單匹檢驗A.1.4.1單匹拉胃檢驗法將孟體置于滅菌器皿中，用滅菌生理鹽水洗滌3次，在板上用檢蚤鑷解剖，將蚤的后胸背板和第1腹節(jié)剝開，用一根解剖針固定肛門前方，另一解剖針由頭部刺入往外拉，可把胃拉出，再用白金環(huán)將胃磨破，用于涂片鏡檢或接種培養(yǎng)。A.1.4.2單匹壓碎檢驗法洗蛋后用滅菌玻璃棒壓碎，直接用于涂片鏡檢或接種培養(yǎng)。A.2鼠疫細菌學(xué)四項檢查按第A.1章制備的檢材，直接涂片或用可疑培養(yǎng)物涂片，用95%乙醇或乙醇，乙醚各半的配制液固定10min,取出自然干燥。涂片必須進行革蘭氏染色。有多張涂片時，可行美藍等染色。A.2.1.3形態(tài)觀察如發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性兩極濃染、兩端鈍圓的短小球桿菌，說明符合鼠疫菌的特點。應(yīng)使用新鮮的選擇敏感培養(yǎng)基，常用龍膽紫溶血胰酶消化液瓊脂，培養(yǎng)基中龍膽紫應(yīng)含0.2×10-。增菌培養(yǎng)可用龍膽紫溶血胰磷消化湯等。培養(yǎng)基的pH要求6.9～7.1A.2.2.2接種方法按第A.1章處理的檢材，接種于選擇繳感培養(yǎng)基，同時接種兩個平皿，一個用于分離鼠疫菌；另一個用于噬菌體快速診斷。置28℃~30℃溫箱中培養(yǎng)。每天觀察一次，連續(xù)觀察4d,28℃孵育10h～18h,用顯微鏡觀察到碎玻璃片樣半透明的幼小菌落。24h~48h肉眼可見菌落形成，直徑約0.1mm～0.2mm,中央突出，半透明淡灰色小菌落。鏡下菌落中央呈黃褐色，有粗糙顆粒，邊緣薄半透明有鋸齒狀花邊。觀察中發(fā)現(xiàn)疑似鼠疫菌應(yīng)及時進行純分離，同時進行噬菌體試驗。A.2.3唑菌體試驗A.2.3.1常規(guī)方法凡發(fā)現(xiàn)疑似鼠疫菌應(yīng)鉤菌劃線接種于溶血瓊脂平皿上，用注射器或毛細吸管吸取鼠疫嘩菌體1滴，在平碟劃線上部使其垂直流下，然后置28℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，如出現(xiàn)噬菌斑或噬菌帶即可判定為鼠疫唑菌體試驗陽性。A.2.3.2噬菌體快速診斷按第A.1章處理的檢材，進行培養(yǎng)的同時，進行噬菌體試驗，方法及結(jié)果判定同A.2.3.1。A.2.4動物試驗A.2.4.1接種方法A.2.4.1.1腹腔接種選擇小白服(18g~20g)或豚鼠(250g~300g),先剪去準備注射一側(cè)的腹毛，用碘酒酒精消毒，待干后，將試驗動物頭部放低，尾部提高，提起腹壁緩慢刺入，嚴防刺破內(nèi)臟，小白鼠注人0.2mL~0.4mL;豚鼠注入0,5mL～1,0mL。然后取出注射器，用干棉球在注射部位輕輕壓一下。A.2.4.1.2皮下接種采取由大腿內(nèi)側(cè)進針到皮下，接種劑量同腹腔接種。A.2.4.2飼養(yǎng)觀察A.2.4.2.1接種后的動物應(yīng)置于符合WS233要求的實驗動物觀察室飼養(yǎng)觀察。A.2.4.2.2一般多在1d～3d發(fā)病，發(fā)病時動物萎靡，不攝食，豎毛、弓背，死亡多在3d～7d。A.2.4.2.3動物死亡后應(yīng)即時解剖觀察病變，分離鼠疫菌。如動物第7d仍不發(fā)病，第8d可取出殺死解剖觀察。A.2.5結(jié)果判定四項檢查判定標準見表A.1。5(資料性附錄)鼠疫血清學(xué)和生物學(xué)技術(shù)B.1免疲熒光技術(shù)B.1.1試驗材料B.1.1.1抗原片選無自發(fā)熒光的潔凈玻片，將被檢材料均勻涂于玻片，臟器組織則制成壓印片，自然干燥后，放入乙醚與無水乙醇等量泥合的固定液中，固定30min。B.1.1.2熒光素標記的鼠疫菌特異性F1抗體。B.1.1.3磷酸鹽緩沖液(pH7.0)。B.1.1.40.1%的Even's藍染色液。B.1.1.5甘油緩沖液(甘油9份+pH7.0PBS1份),B.1.2試驗器材熒光顯微鏡，37℃培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、印有10～40小孔的潔凈玻片、微量加樣器容量5μL~B.1.3操作步驟B.1.3.1取出抗原片，室溫干燥后將標記好的熒光抗體或單克隆抗體滴加于已固定的抗原片上，置于濕盒中，37℃溫箱內(nèi)作用30min~40min。B.1.3.2用pH7.0的PBS流洗10min~15min,電扇吹干或室溫自然干燥。B.1.3.30.1%Even'sB.1.3.4滴加甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡下鏡檢。B.1.4結(jié)果判定熒光顯微鏡下，飄疫菌呈很強的翠綠色(或略帶黃綠色)的熒光，菌體膨大，清晰，具有明顯的亮圈。而假結(jié)核菌的熒光弱，呈灰黃或灰白色，無亮圈。B.2鼠疫反向間接血凝試驗(RIHA)B.2.1試驗材料按第A.1章處理的蛋類材料(1:10稀釋)。鼠疫菌F1抗體致繳紅細胞。限疫免疫血清(17100～1)500稀釋)供反向血凝抑制試驗用。B.2.1.41%健康兔血清鹽水。B.2.2試驗器材試管架、小試管，毛細吸管(1mL～10mL)、將通溫箱、恒溫水溶箱。B.2.3操作步驟(試管法)B.2.3.1將潔凈的小試管排列于試管架上。B.2.3.2第1管加0.9mL,其余各管加0.5mL1%健康免血清鹽水。B.2.3.3將被檢材料0.1mL加入第1管，依次作倍比稀釋，最后1管奔去0.5mL。B.2.3.4每管加1滴2.5%鼠疫F1抗體致敏紅細胞(0.05mL),震蕩混勻，置37℃溫箱2h或室溫4h觀察結(jié)果。B.2.4結(jié)果判定試管法以呈現(xiàn)“++”的最高稀釋度為判斷反向血凝試驗陽性的界限：——++++凝集紅細胞鋪滿管底，有明顯折邊；—+++凝集紅細胞鋪滿管底，無折邊；——++紅細胞不完全凝集，管底呈整齊的圓圈，但圈內(nèi)外有明顯的紅細胞凝集；——+管底形咸較小的圓圈，在圈內(nèi)外只有很少的紅細胞凝集；——-紅細胞不凝集，在管底呈點狀或整齊的圓圈。B.2.5反向間接血凝抑制試驗B.2.5.1操作步驟B.2.5.1.1將被檢標本平行稀釋兩列。第1列為反向血凝抑制試驗，第2列為反向血凝試驗。B.2.5.1.2抑制列第1管加0.8mL,,其余各管加0.5ml.1%健康兔血清鹽水；反向血凝列各管內(nèi)均加0.25mL1%兔血清鹽水，B.2.5.1.3第1列第1管內(nèi)加入0.2mL被檢抗原(1:10稀釋)混勻后吸0.5mL.至第1列第2管，吸取0.25mL.至第2列第1管內(nèi)。如此倍比稀釋至第10管，棄0.5mL。B.2.5.1.4于第1列各管加入鼠疫免疫血清0.25mL,37℃溫箱15min。B.2.5.1.5于2列試管中每管加人2.5%F1抗體致敏紅細胞1滴，充分混勻，故37℃溫箱2h后觀察結(jié)果。B.2.5.1.6試驗設(shè)立如下對照：—船釋液+鼠疫F1抗體致敏紅細胞：——稻釋液+單寧酸紅細胞；—籍釋液十鼠疫免疫血清；—被檢標本十單寧酸紅細胞；——已知陽性抗原+鼠疫F1抗體致敏紅細胞；——已知陽性抗原+鼠疫免疫血清+鼠疫F1抗體致敏紅細胞。B.2.5.2結(jié)果判定在試驗對照成立的條件下，抑制列由于鼠疫抗原與鼠疫免疫血清中和，再加入的抗體致敏紅細胞則不在與相應(yīng)的抗原作用，紅細胞不呈現(xiàn)凝集現(xiàn)象。試驗列應(yīng)呈現(xiàn)紅細胞凝集，抑制列和試驗列比較，抑制列滴度低于試驗列兩管以上者為反向血凝抑制試驗陽性。B.3酶聯(lián)免癥吸附試驗(ELISA)——雙抗體夾心法B.3.1試驗材料B.3.1.1包被緩沖濾(0,05riol/LpH9.6碳酸鹽緩沖系統(tǒng))碳酸鈉1.59g,碳酸氫鈉2.93g,燕餾水加至1000mL.。B.3.1.2洗滌緩沖液(PBS0.01mal/Lp?17.4-Tween-20)氯化鈉8.0g,氯化鉀0.2g,磷酸二氣鐘0.2g,磷酸氧二鈉(Na?HPO?·12H?O)2.83g,Tweenr-200.5mL;疊氮鈉(NaN,)0.2g,蒸餾水加至1000mL.。含10%小牛血清的洗滌緩沖液。B.3.1.4磷苯二胺(OPD)底物溶液磷酸氫二鈉(0.2mol/L)25.7mL,檸檬酸鈉溶液(0.1mol/L)24.3mL,鄰苯二胺(OPD)40mg,3%過氧化氫1.5mL,蒸餾水50mL。B.3.1.5終止液(2mol/L硫酸)硫酸58mL,燕餾水442mL。B.3.1.6特檢樣品按A.1處理的蚤類材料。7鼠疫菌F1特異性抗體和酶標記鼠疫菌F1特異性抗體。B.3.2試驗器材酶標儀、恒溫培養(yǎng)箱、聚苯乙婦反應(yīng)板、微量加樣器；容量5μL~50pL,50gL~200pL。B.3.3操作步驟B.3.3.1用包被緩沖液稀釋鼠疫菌F1抗體，每孔加200μL,4℃過夜。B.3.3.2用洗滌緩沖液流洗3次，每次3min~5min。B.3.3.3用洗滌緩沖液將待測樣品稀釋成不同濃度，每孔加200μL,置37℃解育2h。B.3.3.5加人酵標記限疫菌抗體，每孔200μL,37℃解育2h,B.3.3.6重復(fù)B.3.3.2。B.3.3.7加人底物每孔加入200pL,置37℃溫箱作用15min~20min。B.3.3.8加入終止劑(2mol/LH?SO?)每孔加入50pL。B.3.3.9設(shè)立陰性對照、陽性對照和空白對照。B.3.3.10用酶標儀，以492nm波長，測定A值。B.3.4結(jié)果判定B.3.4.1同時符合下列兩個條件者，判為陽性：——待測抗原與特異性抗體反應(yīng)的A值≥0,2;——待測抗原與特異性抗體反應(yīng)的A值/陰性對照抗原與特異性抗體反應(yīng)的A值≥2.1。B.3.4.2均不符合上述兩個條件者，判為陰性。B.3.4.3僅有1項～2項符合者，判為可疑。應(yīng)選用同一種方法或另一種方法重試。B.4聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)B.4.1試驗材料B.4.1.1TagDNA聚合陶和濃縮反應(yīng)緩沖液。B.4.1.2dNTP混合物(含dATP、dCTP,dGTP,dTTP)。B.4.1.3DNA提取試劑盒。—F1上游引物：5'GGAACCACTAGCACATCTGTT3':—F1下游引物：5'-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCCB.4.1.5無菌三蒸水。B.4.1.6液體石蠟。B.4.2試驗器材PCR基因擴增儀、瓊脂凝膠電泳儀、紫外線投射儀，高速臺式離心機、微量移液器(5pL～20pL;20μL~200pL)及滴頭、0.2mL～1.5mL微量塑料離心管。B.4.3操作步驟B.4.3.1標本處理將量放入乳缽內(nèi)，用無菌生理鹽水洗三次，研碎，加0.5mL生理鹽水，移人試管中，100℃水煮沸10min,5000g/min離心5min,取上清液直接用于PCR。B.4.3.2.1可按說明書操作。一般25pL.反應(yīng)體積中含有以下組分：——模板DNA(25ng/pL)2.0p—上游引物(25pmol/L)1.0pL;—下游引物(25pmol/L)1.0pL;—氯化鎂(25mmol/L)3.0pL;—TagDNA聚合酶(4U/pL)0.25pLr2.0pLr—10×PCR緩沖液(freeMgCl)2.5pL;——三蒸水13.25pL;——充分混勻后，加25μL液體石蠟覆蓋。B.4.3.2.2反應(yīng)條件：變性95℃5min,1個循環(huán)，然后95℃1min,56℃1min,72℃2min,30個循環(huán)。B.4.3.3PCR擴增產(chǎn)物分析取10pL~15pL擴增產(chǎn)物加到含有0.8%～2%GoldviewDNA染料的1%瓊脂糖凝膠上100V,電泳1.5h,在紫外透射燈下觀察或凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。B.4.3.4設(shè)立對照陽性對照；已知鼠疫菌F1抗原DNA模板加其他所有反應(yīng)體系成分；陰性對照；已知鼠疫菌F1抗原陰性的DNA為模板加其他所有反應(yīng)體系1擴增系統(tǒng)對照：三蒸水加除引物外的其他所有反應(yīng)體系。B.4.4結(jié)果判定在對照管成立的情況下，在實驗管中出現(xiàn)249bp長度擴增產(chǎn)物判定為陽性。9(資料性附錄)莫氏立克次體病原學(xué)檢測方法C.1涂片檢查將孟置于載物片上，用鑷子壓碎。用力涂抹，將蚤胃部分涂在玻片上，用姬姆薩或姬姆尼茨染色，在油鏡下觀察，姬姆薩染色立克次體呈紫紅色；姬姆尼茨染色立克次體量紅色。C.2莫氏立克次體分離C.2.1標本處理將分好組的蛋置于滅菌乳缽內(nèi)，用滅菌生理鹽水洗3次，再用1;10000IU的雙抗(青、鏈霉素)浸泡10min,吸干洗液，把處理過的蚤放入乳缽中，加少量海砂研細，加入蔗糖-磷酸鹽緩沖液(SPG)或生理鹽水稀釋成1:100懸液，低速離心，去掉沉渣，離心取上清液用作PCR模板和分離材料。C.2.2分離培養(yǎng)C.2.2.1