隱地疫霉菌檢疫鑒定方法

本標準規(guī)定了進出境植物檢疫中隱地疫霉菌的檢疫和鑒定方法。本標準適用于進出境植物及介質土中隱地疫霉菌的檢疫和鑒定。2.1分類地位隱地疫霉菌(PhytophthoracryptogeaPethybridge&.Lafferty)屬藻菌界(Chromista),(Oomyeota),腐霉目(Pythiales),腐霉科(Pythiaceae),疫霉屬(Phytophthora)。2.2檢疫原理隱地疫霉菌的寄主植物很廣，為害上百種經濟作物，是非淵菊、翠菊、麝香石竹、圣誕花、番茄等植物的重要病原菌(參見附錄A)。主要以抗逆性很強的卵孢子在介質土中及寄主殘體內越冬并長期生存，當田間溫度和濕度適宜時，卵孢子打破休眠萌發(fā)，產生孢子囊。孢子囊在雨后或灌溉后有積水時，根快釋放出大量游動孢子，最終通過幼根或傷口侵入寄主，可造成根、莖部腐爛，致使植物受侵染后葉片迅速萎鳶枯死，2.3鑒定依據隱地疫霉菌在寄主植物上的癥狀，病原菌形態(tài)學特征、生物學特征是鑒定該菌的依據。3儀器設備及實驗用具3.1儀器設備生物顯微鏡、體視顯微鏡、高壓滅菌器、干熱滅菌器、普通天平、分析天平、超凈工作臺、生物培養(yǎng)箱。3.2實驗用具(carbendaxim)、硝酸鈣[Ca(NO,),].磷酸二氧鉀(KH?PO?),硝酸鎂[Mg(NO):].氯化鈣(CaCl),利福平(rifampirin)、碳酸鈣(CaCO.)、無水乙醇(ethanel)。5培養(yǎng)基5.1基礎培養(yǎng)基用于隱地疫毒菌的保存和培養(yǎng)性狀的觀察，測定。采用胡蘿卜培養(yǎng)基(CA),V,培養(yǎng)基(V?A)或利馬豆培養(yǎng)基(LBA),其配制方法及步驟見第B.1章。5.2選擇性培養(yǎng)基用于隱地疫霉菌游動孢子的萌發(fā)，病原菌的分離和純化。1000mL基礎培養(yǎng)基經常規(guī)滅菌并冷卻到55℃左右時加入下列抗菌素(均為有效成分);氨下青霉素50mg,利福平20mg、多菌靈25mg、五氯硝基苯25mg,據勻，制成平皿。在缺乏五氯硝基苯時可用相同藥量的苯來特替代。邊緣明顯，在無菌水或皮氏培養(yǎng)液中，可產生少量的孢子囊，加入葉則誘導大量孢子囊產生。7.2形態(tài)特征7.2.1菌絲和菌絲體在CA培養(yǎng)基上，菌絲體大量產生。菌絲無色無隔、粗細均勻；粗4ym～6.5pm,可產生球形、角形或不規(guī)則形菌絲膨大體，串生或交織成網狀。7.2.2無性生殖階段特征(參見附錄C)在皮氏培養(yǎng)液中，孢囊梗直接來源于菌絲，不分枝，粗3.0μm～6μm。孢子囊橢圓形，罕卵形，有時中部縊縮，(34gm～64pm)×(17pm～36pm),平均46.4pm×27,8μm,長寬比值為1.4～2.2,平均1.66,頂部平展，無乳突，排抱孔寬10pm～17pm,不脫落，內部層出3次～6次。游動抱子囊在冷涼條件下釋放游動泡子，游動孢子腎形，(10μm～13pm)×(8pm～10gm),鞭毛長21pm～34μm,體止孢子球形，直徑8μm~13μm。厚垣抱子未見。7.2.3有性生殖階段特征(參見附錄C)有性繁殖為異宗配合。藏卵器球形，壁薄，褐色，21μm～31pm,柄棍樺狀或圓錐狀；維器球形或圓簡形，圍生，(10pm～15pm)×(7pm~18μm),具1個~2個細胞。卵抱子球形，直徑17pm~27pm,7.3菌絲最高溫度測定從新鮮培養(yǎng)的菌落邊緣挑取直徑2mm左右的菌絲塊，移至基礎培養(yǎng)基平板上，菌絲塊等距離接種于培養(yǎng)皿周緣，每培養(yǎng)皿(直徑9cm)4塊～6塊，置于35℃培養(yǎng)，設三個重復，5d后測量菌落直徑。隱地疫毒菌絲在35℃不能生長。7.4致病性試驗接種15d內，非洲菊出現典型的萎海癥狀，番茄猝倒死亡，而黃瓜，西瓜不發(fā)病。必要時，在病健交界處但遠離接種點的部位，切取數段發(fā)病植株的莖桿，直接放在選擇性培養(yǎng)基上進行分離培養(yǎng)，觀察分離到菌株的形態(tài)特征(參見7.2)。7.5隱地疲霉菌與其近似種的主要區(qū)別隱地疫霉菌與其近似種據代疫霉菌的主要區(qū)別參見附錄D。8結果評定以隱地疫霉菌在非洲菊上產生的癥狀，分離物的培養(yǎng)特征，無性及有性階段特征，致病性特征及菌絲生長最高溫度等作為鑒定依據，進行綜合判定。若以上特征與第7章鑒定特征吻合，則鑒定為隱地疫霉菌。9菌株保存隱地疫毒的菌株應移到試管斜面上，經登記后量于10℃~15℃黑暗條件下保存，并定期(每3個月)轉管，防止因斜面干燥面造成病原菌死亡。菌襪至少保存6個月，保存期滿后，需經滅菌處理。(資料性附錄)隱地疫霉菌的寄主與地理分布隱地疫霉菌的寄主范圍很廣，寄主包括23科近百種植物，其中主要的經濟作物有：非淵菊(Gerbera(MatthiolaincanaR.Br.)、雪蘭(FreesiarefractaKlatt.),瓜葉菊(CinerariacrwentaMasson),矮牽牛(PetwniahybridaVilm.)、圣誕花(EuporbiapulcherrimaWilld.)、麒麟(CarthamustinctariusLL),冷杉(AbiesfabriCraih),山松(PimusmuntecamaeLamb,)等。A.2地理分布大洋州：澳大利亞、新西蘭。俄羅斯。(資料性附錄)培養(yǎng)基及配制方法B.1基礎培養(yǎng)基B.1.1胡蘿卜培養(yǎng)基(CA)將200g新鮮胡蘿卜切成小片，加去離子水500ml.,用組織搗碎機搗碎約40s,用4層紗布過能去渣，補足水至1000mL,加入瓊脂粉15g～20g,121℃高壓蒸汽滅菌15min~20min。5mLV;計加去離子水90mL,碳酸鈣0.02g,瓊脂粉2g,補足水至100mL。121℃高壓燕汽滅菌B.1.3剩馬豆培養(yǎng)基(LBA)干利馬豆粉60g,瓊脂粉20g,蒸餾水1000mL.。利馬豆粉60g加水1000mL,在60℃下水浴1h,雙層紗布過濾去渣。上清液補足水至1000mL,加入瓊脂粉20g,煮沸后持續(xù)沸騰數分鐘。121℃高壓燕汽滅菌15min~20min。B.2皮氏(Petri)培養(yǎng)液在121℃下高壓蒸汽滅菌15min~20min。(資料性附錄)隱地疫霉的形態(tài)特征圖圖C.1隱地疫霉的形態(tài)特征圖(仿余永年，1998)(資料性附錄)隱地疫霉及近似種的主要區(qū)別大于35℃仍可生長。最高達36℃~37℃。