實驗二蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應

關(guān)于實驗二蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應實驗二、蛋白質(zhì)及氨基酸的顯色反應目的和要求

1.學習和了解常用的幾種鑒定蛋白質(zhì)與氨基酸的方法。

2.進一步認識氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅰ、雙縮脲反應(Biureareaction)原理:

雙縮脲反應:在堿性條件下，雙縮脲與二價銅離子作用，生成紫紅色配合物的反應。當加熱至180℃左右時，兩分子尿素縮合脫去一分子氨，生成雙縮脲。在肽和蛋白質(zhì)分子中具有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反應，生成藍紫色或紫紅色的配合物。該反應常用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。此反應所產(chǎn)生顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)。第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天紫紅色銅雙縮脲復合物分子結(jié)構(gòu)為：第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟一、取少量尿素結(jié)晶，放入干燥試管中，用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷卻后，加10%NaOH溶液約1mL，振蕩混勻，再加入1%CuSO４溶液1滴，振蕩之。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。（避免添加過量硫酸銅，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色）。

二、取另一支試管，加1mL蛋白質(zhì)溶液和10%氫氧化鈉溶液2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液兩滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。

第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ、茚三酮反應(Ninhydrinreaction)原理:

除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應生成黃色物質(zhì)外，所有的α-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應生成藍紫色物質(zhì)。該反應分兩步進行，首先是氨基酸被氧化，產(chǎn)生CO２、NH3

和醛，而水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所生成之還原型茚三酮與另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質(zhì)。

第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅱ、茚三酮反應(Ninhydrinreaction)

此反應的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。該反應十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能顯示反應，因此是一種常用的氨基酸定量方法。第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

一、取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混勻，在沸水浴中加熱1~2min，觀察顏色由粉色變成紫紅色再變藍。二、在一小片濾紙上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅲ、黃色反應(Xanthoproteicreaction)原理凡是含有苯環(huán)的化合物都能與濃硝酸作用產(chǎn)生黃色的硝基苯衍生物。該化合物在堿性溶液中進一步轉(zhuǎn)化成深橙色的硝醌酸鈉。在蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基易發(fā)生上述反應，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸催化才能呈明顯的正反應。皮膚、指甲、頭發(fā)等遇濃硝酸變黃即為這一反應的結(jié)果。第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟:

一、取一支試管加4滴0.5%苯酚溶液，再加濃硝酸2滴，觀察黃色出現(xiàn)，冷卻后逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，觀察顏色轉(zhuǎn)變?yōu)槌?。二、取一支試管加蛋白質(zhì)溶液4滴及濃硝酸2滴，由于強酸的作用，開始蛋白質(zhì)形成白色沉淀，小火加熱，則沉淀變?yōu)辄S色，冷卻之，逐滴加入10%氫氧化鈉溶液，顏色由黃色轉(zhuǎn)變成深橙黃色。三、剪少許指甲或頭發(fā)放入試管中，加入數(shù)滴濃硝酸，觀察顏色變化。

第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天管號1234材料0.5％苯酚雞蛋清液指甲頭發(fā)量（滴)44少許少許濃硝酸（滴）422020現(xiàn)象加入NaOH后現(xiàn)象變化黃色反應第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅳ、坂口反應(Sakaguchireaction)原理

在次溴酸鈉或次氯酸鈉存在的條件下，許多含有胍基的化合物(如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能與α-萘酚發(fā)生反應生成紅色物質(zhì)。在20種氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反應。第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅳ、坂口反應(Sakaguchireaction)

生成的氨被次溴酸鈉或次氯酸鈉氧化生成氮。該反應中過量的次溴酸鈉或次氯酸鈉是不利的，因其能進一步緩慢氧化，使產(chǎn)物破裂分解，引起顏色消失。但加入適量尿素可破壞過量的次溴酸鈉。酪氨酸、色氨酸和組氨酸也能降低產(chǎn)生顏色的強度。甚至會阻止顏色的生成。該反應靈敏度達1：250000。因此常用于定量測定精氨酸的含量和定性鑒定含有精氨酸的蛋白質(zhì)。第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

取2支試管，分別加入1mL0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氫氧化鈉溶液5滴，1%α-萘酚酒精溶液2滴，次氯酸鈉溶液6滴，搖勻，放置片刻，觀察出現(xiàn)的顏色。第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天試劑（滴）管號H2O0.3％精氨酸蛋白質(zhì)溶液20％NaOHα－萘酚NaClO現(xiàn)象記錄１005536２050536３500536坂口反應第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅴ、乙醛酸反應(Adamkiewica-Hopkins-Colereaction)原理

在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應生成紫色物質(zhì)，色氨酸在濃硫酸中與一些醛類反應也形成有色物質(zhì)。很多人用含有少量醛雜質(zhì)的冰醋酸或芳香醛等進行此反應。硝酸根、亞硝酸根、氯酸根及過多的氯離子均能妨礙此反應，有微量硫酸銅或Fe３＋離子存在時，可以加強色氨酸的陽性反應。第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

向試管中加數(shù)滴蛋白質(zhì)溶液，再加冰醋酸(常含有少量乙醛酸或醛類)約1mL并混勻傾斜試管，謹慎地沿著管壁加濃硫酸(AR)約1mL，使其重迭，且勿搖勻。靜置后，觀察在兩液界面上出現(xiàn)的紅紫色環(huán)，于水浴中微熱，可加快色環(huán)形成。第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

試劑（滴）管號白明膠0.3％色氨酸（滴）蛋白質(zhì)溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn)象記錄151125113511乙醛酸反應第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Ⅵ、偶氮反應(Azoreaction)原理

偶氮化合物(Ehrlich氏偶氮試劑)與酚核或咪唑環(huán)結(jié)合產(chǎn)生有色物質(zhì)。它與酪氨酸和組氨酸反應的產(chǎn)物分別為紅色和櫻桃紅色.含有酪氨酸和組氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天操作步驟

取2支試管，分別加入0.3%組氨酸溶液和純雞蛋清各4滴，再各加入新配制的重氮試劑8滴搖勻，加入2滴20%氫氧化鈉溶液，再搖勻。過幾分鐘，觀察顏色的形成，一般出現(xiàn)櫻桃紅色。第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

試劑（滴）管號0.3％組氨酸（滴）雞蛋清（滴）偶氮試劑20％NaOH溶液現(xiàn)象記錄14822482偶氮反應第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天反應名稱反應基團反應產(chǎn)物及現(xiàn)象用途1、雙縮脲反應肽鍵Cu–Cu—雙縮脲絡合物（蘭紫色）測蛋白質(zhì)含量鑒定蛋白質(zhì)水解是否完全2、茚三酮反應α-氨基酸蘭紫色測AA含量檢驗AA及蛋白質(zhì)3、黃色反應苯環(huán)、Trp、Tyr黃色硝醌酸生成鑒定Trp、Tyr4、坂口反應胍基玫瑰紅色產(chǎn)物生成鑒定Arg測定Arg含量5、乙醛酸反應吲哚環(huán)中間生成蘭紫色環(huán)鑒定Trp6、偶氮反應酚核、咪唑基有橙色和鮮紅色產(chǎn)物生成鑒定His、Tyr第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天試劑和器材

一、試劑

1.蛋白質(zhì)溶液：取5mL蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后，用紗布過濾。2.0.1%茚三酮乙醇溶液：稱取0.1g茚三酮，溶于100mL95%乙醇。臨用前配制。3.尿素粉末4.1%硫酸銅溶液5.10%氫氧化鈉溶液和20%氫氧化鈉溶液6.0.5%苯酚溶液第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天7.濃硝酸和濃硫酸(A.R.)8.0.1%茚三酮水溶液9.0.3%精氨酸、0.3%組氨酸、0.5%甘氨酸10.純雞蛋清11.1%α-萘酚乙醇溶液，臨用時配制12.冰乙酸13.次氯酸鈉溶液14.Ehrlich氏重氮試劑：溶液A：溶解5g亞硝酸鈉于1000mL水中。溶液B：溶解5g對氨基苯磺酸于1000mL水中。溶解后，再加入5mL濃硫酸。

A、B溶液分別保存于密閉瓶內(nèi)。需用時，以1：1的比例混合。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二、器材

1.試管及試管架2.水浴鍋3.酒精燈4.濾紙片5.烘箱