Taq DNA聚合酶耐熱域的克隆及分析的開(kāi)題報(bào)告

TaqDNA聚合酶耐熱域的克隆及分析的開(kāi)題報(bào)告一、選題背景與意義TaqDNA聚合酶是一種從熱泉嗜好菌Taq提取的一種復(fù)制酶，因?yàn)樗诟邷叵氯阅軌蚧顒?dòng)，所以在分子生物學(xué)中，特別是在PCR反應(yīng)中得到了廣泛的應(yīng)用。TaqDNA聚合酶的耐熱性是由其C端區(qū)域的耐熱域所提供的。因此，對(duì)TaqDNA聚合酶耐熱域的分析可以幫助人們更好地了解該酶的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，提高PCR反應(yīng)的靈敏度和特異性。二、研究目的本文旨在克隆TaqDNA聚合酶耐熱域，并利用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，探討TaqDNA聚合酶耐熱域的結(jié)構(gòu)和功能。三、研究?jī)?nèi)容1.利用PCR技術(shù)從Taq細(xì)胞中擴(kuò)增出TaqDNA聚合酶基因；2.克隆TaqDNA聚合酶基因，構(gòu)建其表達(dá)載體；3.利用生物信息學(xué)工具對(duì)TaqDNA聚合酶的序列進(jìn)行分析和比對(duì)，確定耐熱域的位置和序列特征；4.構(gòu)建含有不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域的表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)和純化；5.對(duì)不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域進(jìn)行活性分析和熱穩(wěn)定性分析。四、研究方法1.PCR擴(kuò)增：利用TaqDNA聚合酶基因的引物，在Taq菌株中擴(kuò)增TaqDNA聚合酶基因片段；2.克隆：將TaqDNA聚合酶基因片段插入表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到大腸桿菌表達(dá)的TaqDNA聚合酶；3.生物信息學(xué)分析：采用NCBIBLAST分析軟件對(duì)TaqDNA聚合酶序列進(jìn)行比對(duì)和分析，確定耐熱域的位置和特征；4.表達(dá)和純化：選用不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)和純化；5.活性和熱穩(wěn)定性分析：采用PCR技術(shù)和其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域進(jìn)行功能分析和熱穩(wěn)定性分析。五、預(yù)期結(jié)果1.成功克隆TaqDNA聚合酶基因；2.成功構(gòu)建TaqDNA聚合酶的表達(dá)載體，可以表達(dá)出TaqDNA聚合酶；3.分析TaqDNA聚合酶序列，確定耐熱域的位置和特征；4.構(gòu)建不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域表達(dá)載體，并成功表達(dá)和純化；5.進(jìn)行活性和熱穩(wěn)定性分析，比較不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域的活性和熱穩(wěn)定性。六、可行性分析本研究所需的PCR技術(shù)、分子克隆技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)以及常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在實(shí)驗(yàn)室中均有成熟的操作方法和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，因此該研究具有較高的可行性。七、研究進(jìn)度安排第一年：利用PCR技術(shù)從Taq細(xì)胞中擴(kuò)增出TaqDNA聚合酶基因；克隆TaqDNA聚合酶基因，構(gòu)建其表達(dá)載體。第二年：利用生物信息學(xué)工具對(duì)TaqDNA聚合酶的耐熱域進(jìn)行分析和比對(duì)；構(gòu)建含有不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域的表達(dá)載體，并進(jìn)行表達(dá)和純化。第三年：對(duì)不同長(zhǎng)度和位置的TaqDNA聚合酶耐熱域進(jìn)行活性分析和熱穩(wěn)定性分析；撰寫(xiě)論文并準(zhǔn)備發(fā)表。八、參考文獻(xiàn)1.MullisK.B.(1990)Theunusualoriginofthepolymerasechainreaction.ScientificAmerican,262(4):56-65.2.SaikiR.K.,GelfandD.H.,StoffelS.,etal.(1988)Primer-directedenzymaticamplificationofDNAwithathermostableDNApolymerase.Science,239(4839):487-491.3.胡安弘,張中順,應(yīng)洪波.分子