肉桂醇脫氫酶Cinnamyl-alcoholdehydrogenaseCAD試劑盒說明書

第第頁肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl—alcoholdehydrogenase，CAD）試劑盒說明書肉桂醇脫氫酶（Cinnamylalcoholdehydrogenase，CAD）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務(wù)必取23個預(yù)期差別較大的樣本做猜測定測定意義：CAD是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，是木質(zhì)素單體合成反應(yīng)中的最終一步，催化多種不同的肉桂醛（香豆醛、芥子醛以及松柏醛等）生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)供應(yīng)依據(jù)。測定原理：CAD催化肉桂醇和NADP生成肉桂醛和NADPH，在340nm下測定NADPH生成速率，即可反映CAD活性。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的構(gòu)成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保管；試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保管；試劑二：粉劑×2瓶，20℃保管；粗酶液提取：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。測定步驟：1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測定（1）在試劑二中加入10mL試劑一充分溶解混勻，室溫使用渦旋振蕩儀振蕩溶解15min，如未溶解可適當(dāng)延長振蕩時間；置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立刻記錄340nm處初始吸光值A(chǔ)1和5min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2A1.CAD活性計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=643×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=643×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=1.286×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，5min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。b.用96孔板測定的計算公式如下1）按樣本蛋白濃度計算：單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=1286×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算：單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=1286×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。CAD（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=2.572×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光