微生物菌種的篩選及鑒定

關于微生物菌種的篩選及鑒定本節(jié)要點食品工業(yè)上典型的微生物菌種微生物菌種的分離篩選及鑒定微生物菌種的發(fā)酵條件優(yōu)化第2頁,共70頁，2024年2月25日，星期天一、典型工業(yè)微生物菌種細菌：枯草桿菌，短桿菌，大腸桿菌酵母：釀酒酵母（啤酒，葡萄酒），酒精酵母，假絲酵母霉菌：黑曲霉，土曲霉，米曲霉，紅曲霉，根霉，木霉，青霉放線菌：單孢菌其他：藻類第3頁,共70頁，2024年2月25日，星期天發(fā)酵工業(yè)常見常用的細菌Leuconostocmesenteroides腸膜明串珠菌Pediococcuscerevisiae

啤酒足細菌Bacillussubtilis

枯草芽孢桿菌Acetobacteraceti

醋化醋桿菌Lactobacillusdelbrukii

德氏乳桿菌Steptococcuslactis

乳鏈球菌Clostridiumacetobutylcum丙酮丁醇梭菌

Corynebacterumpekinese

北京棒桿菌Brevibacteriumammoniagenes產氨短桿菌第4頁,共70頁，2024年2月25日，星期天常見工業(yè)微生物及其產物細菌短桿菌：谷氨酸、肌苷酸枯草芽孢桿菌：淀粉酶、蛋白酶、核糖大腸桿菌：酰胺酶節(jié)桿菌：強的松梭狀桿菌：丙酮、丁醇第5頁,共70頁，2024年2月25日，星期天6工業(yè)上常用的放線菌及產物鏈霉菌屬Streptomyces

生產抗生素、維生素、酶及酶抑制劑諾卡氏菌屬Nocardia

生產抗生素，石油脫蠟、烴類發(fā)酵，處理含氰廢水小單孢菌屬Micromonospora

慶大霉素，Rifamycin孢囊鏈霉菌屬Streptosporanium

多霉素放線菌第6頁,共70頁，2024年2月25日，星期天酵母酒精酵母：乙醇甘油酵母：甘油假絲酵母：環(huán)烷酸、SCP啤酒酵母：細胞色素、輔酶、酵母片類酵母：脂肪酶阿氏假囊酵母：核黃素脆壁酵母：乳糖酶常見工業(yè)微生物及其產物第7頁,共70頁，2024年2月25日，星期天霉菌黑曲霉：檸檬酸、蛋白酶、單寧酶、糖化酶棲土曲霉：蛋白酶根霉：糖化酶、甾體激素、青霉：青霉素、葡萄糖氧化酶木霉：纖維素酶紅曲霉：糖化霉、紅曲色素常見工業(yè)微生物及其產物霉菌分生孢子第8頁,共70頁，2024年2月25日，星期天SaccharomycescerevisiaeBEERBacillussubtilisB53NATTO第9頁,共70頁，2024年2月25日，星期天工業(yè)上對生產菌種的基本要求從自然界中分離目的菌種的原則菌種選育的一般方法二、食品工業(yè)微生物菌種的來源第10頁,共70頁，2024年2月25日，星期天112.1對工業(yè)微生物菌種的基本要求能夠利用廉價的原料，簡單的培養(yǎng)基，大量高效地合成產物有關合成產物的途徑盡可能地簡單，或者說菌種改造可操作性要強遺傳性能要相對穩(wěn)定不易感染雜菌或噬菌體產生菌及其產物的毒性必須考慮（在分類學上最好與致病菌無關）生產特性要符合工藝要求第11頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.2從自然界中分離篩選菌種生產菌株來源

1、索取或購買2、自己選育用原有菌株進行遺傳改造進行育種誘變育種/基因重組育種向菌種保藏機構索取、購買出發(fā)菌株進行選育從自然界中分離菌種

從自然界中分離菌種就是從自然界微生物資源中有目的、快速、準確地選出所需要的菌種。第12頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

設計方案→采樣→增殖培養(yǎng)*→平板分離→篩選（初篩、復篩）→單株純種分離→性能考察（生產性能試驗、毒性試驗、菌種鑒定）從自然界中分離篩選菌種的一般步驟2.2.1采樣

從自然界種采集含目的菌的樣品第13頁,共70頁，2024年2月25日，星期天1. 環(huán)境條件對土樣本中微生物分布的影響（1） 營養(yǎng)環(huán)境①高糖環(huán)境（加工蜜餞、糖果、蜂蜜的環(huán)境）土壤中：耐滲透壓酵母，檸檬酸產生菌，氨基酸產生菌；②富含淀粉環(huán)境污泥、水溝旁土壤中：淀粉酶產生菌；③森林中腐葉爛草下土壤：纖維素酶產生菌；④含蛋白質（蠶絲、豆餅、生皮曬廠）土壤中：蛋白酶產生菌；⑤油田土：石油分解菌；第14頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（2） 水分①取離地表5-15cm的土樣②含水過多、過少都不理想（3） 溫度：采樣以秋季為好（4） 通風（5）酸堿度：細菌、放線菌：中性或偏堿；霉菌、酵母：偏酸第15頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.采樣方法（1） 去除表層土（2） 取5-15cm土樣幾十克，裝入無菌牛皮低袋或逆料袋中3. 注意記錄：時間，地點，環(huán)境情況等樣品袋應封好口，防止水分失去土樣應在分離前破碎盡快分離第16頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.2.2增殖培養(yǎng)（富集培養(yǎng)）適用：樣品中目的菌數量不夠多時目的：提高樣品中目的菌的數量和比例原理：通過控制營養(yǎng)成分或培養(yǎng)條件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生長受到抑制第17頁,共70頁，2024年2月25日，星期天1、方法（1） 控制營養(yǎng)成分

①

纖維素為唯一碳源，可增殖分解纖維素的菌②可溶性淀粉為唯一碳源，可增殖產淀粉酶的菌種③酒精廢水，可以增殖廢水利用菌*多種微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素（2） 控制培養(yǎng)基pH

細菌、放線菌：中性偏堿，真菌：偏酸

但非目的菌的生長不能被完全抑制第18頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（3）控制培養(yǎng)溫度30℃左右培養(yǎng)，可培殖嗜溫微生物50~60℃培養(yǎng)，可培殖嗜熱微生物，篩選耐熱菌株（4）熱處理——增殖芽孢細菌樣品懸浮液經80℃、10min處理，殺死營養(yǎng)體，再添加營養(yǎng)培養(yǎng)后可增殖產芽孢細菌第19頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（5）添加抑制劑10%苯酚數滴：抑制細菌、霉菌生長，增殖放線菌多粘菌素B：抑制G-細菌青霉素：抑制G+細菌制霉菌素：抑制真菌放線菌酮：抑制真菌第20頁,共70頁，2024年2月25日，星期天21實例：堿性纖維素酶產生菌的篩選↓采樣（造紙廠）→80℃30min處理文獻:產生菌為中性芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌、放線菌及霉菌0.0075%曲利本藍＋1%CMC（羧甲基纖維素），pH10.5培養(yǎng)3～4d，選擇有凹陷圈的菌落從285個土樣中獲得62株26株為組成型36株為誘導型第21頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.2.3純種分離目的：將目的菌從混雜的微生物中分離出來，獲得純培養(yǎng)1 純種分離的一般方法稀釋平板法傾注平板或涂布平板劃線法第22頁,共70頁，2024年2月25日，星期天稀釋分離涂布平板第23頁,共70頁，2024年2月25日，星期天稀釋分離傾注平板第24頁,共70頁，2024年2月25日，星期天劃線分離第25頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（3）組織培養(yǎng)法適用于分離高等真菌及植物病原菌高等真菌：如香菇→切1小塊菌蓋→10%漂白粉消毒處理→無菌水沖洗→置瓊脂平板上→培養(yǎng)→長出菌絲體注意：對蔓延性霉菌：①

加1%去氧膽酸鈉②

察氏培養(yǎng)基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖第26頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2、平皿反應快速檢出法——定性或半定量（1）紙片培養(yǎng)顯色法濾紙飽浸含有指示劑的液體培養(yǎng)基用接種環(huán)接種保濕恒溫培養(yǎng)據菌落周圍變色圈和菌落直徑比值判別目的物產量（2）透明圈法

根據瓊脂培養(yǎng)上透明圈/菌落直徑大小判別目的產物的產量淀粉平板透明圈：淀粉酶碳酸鈣平板透明圈：產酸酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶第27頁,共70頁，2024年2月25日，星期天

以大腸桿菌E.coliATCC80739為指示菌，對枯草芽孢桿菌R21-4進行紫外誘變，篩選得到一株具有良好遺傳穩(wěn)定性的枯草芽孢桿菌R21-15，抗菌蛋白的效價提高58.49%。第28頁,共70頁，2024年2月25日，星期天粗提蛋白對棉花黃、枯萎病菌的抑制作用

第29頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（3）變色圈法淀粉平板噴稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶支鏈淀粉平板噴稀碘液：藍色圈：異淀粉酶無色圈：液化型淀粉酶葡聚糖平板加剛果紅：葡聚糖酶木聚糖平板加剛果紅：木聚糖酶第30頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（4）生長圈法工具菌：營養(yǎng)缺陷型，不能合成的物質（生長因素）為目的菌積累的產物菌落形態(tài)明顯不同于目的菌方法：106~107工具菌與樣品稀釋液一起涂布至瓊脂培養(yǎng)基表面，具有生長圈的菌落即為目的菌適用：氨基酸，核苷酸，維生素產生菌的選育第31頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（5）抑制圈適用：抗生素產生菌的選育工具菌：對目的抗生素敏感的微生物例：目的菌為產生抗G+細菌的抗生素的菌株工具菌可使用金黃色葡萄球菌方法目的菌分離：稀釋分離法，培養(yǎng)長出菌落代謝物積累：用打孔器（6MM）將菌落連同周圍瓊脂培養(yǎng)基一起取下，放一無菌空培養(yǎng)皿內，保濕培養(yǎng)4-5d，使新產生抗生素積累于小瓊脂塊中測定：取107工具菌涂布于瓊脂培養(yǎng)基，將小瓊脂塊放于上面培養(yǎng)過夜，抑菌圈的出現，說明瓊脂塊中有抗生素，大小說明抗生素單位的高低第32頁,共70頁，2024年2月25日，星期天瓊脂塊培養(yǎng)法篩選抗生素產生菌程序第33頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（6）菌落特征

從形態(tài)的角度菌落的外觀形態(tài)，是微生物的一個重要表征。如多糖產生菌在適當的培養(yǎng)基上生長，從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識別。第34頁,共70頁，2024年2月25日，星期天35（7）從產物角度出發(fā)在培養(yǎng)時以產物的形成有目的的設計培養(yǎng)基利用簡單、快速的鑒定方法，如抗生素產物分子的結構定性分析（利用紫外掃描光譜、核磁共振、CD譜、高壓液相色譜、遠紅外分析、X-射線衍射分析、穆斯堡爾譜等）產物的定量分析第35頁,共70頁，2024年2月25日，星期天3、厭氧性微生物的分離法（1）去除培養(yǎng)基中的溶解氧，降低Eh（氧化還原電位）煮沸法：將培養(yǎng)基置沸水中煮沸15分鐘，驅除其中的溶解氧，勿再搖動，Eh可降至0.1V以下培養(yǎng)基預還原：將培養(yǎng)基中加入還原性物質：半胱氨酸，巰基化生物，Na2S，抗壞血酸等降低Eh第36頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（2）創(chuàng)造無氧環(huán)境物理除氧空氣置換法：干燥器或厭氧培養(yǎng)罐抽真空76mmHg→充入N2（反復3次）→充入CO210%+H210%+N280%化學除氧

H2+O2→H2O(鈀作催化劑）GASPAK罐除氧：硼氫化鈉、檸檬酸，碳酸氫鈉化學反應產生H2

和CO2，H2與O2反應生成水厭氧指示劑第37頁,共70頁，2024年2月25日，星期天（3）厭氧分離（培養(yǎng)）技術高層瓊脂柱技術厭氧罐技術厭氧手套箱技術厭氧手套箱第38頁,共70頁，2024年2月25日，星期天厭氧培養(yǎng)裝置第39頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2.2.4篩選1、初篩：通風發(fā)酵菌種，通過搖瓶發(fā)酵進行，每株一瓶目的：淘汰80%-90%的分離菌株中的低產菌（1）培養(yǎng)條件：主要通過查閱資料及需要而預先決定：如培養(yǎng)基組成，通風量（裝液量，搖瓶機轉數），pH、溫度、培養(yǎng)時間等。（2）分析測定：最好定量，如較困難時可采取半定量方法第41頁,共70頁，2024年2月25日，星期天2、復篩：每株3~5瓶，可提前培養(yǎng)種子，使接種量比較一致，3~5%接種量，培養(yǎng)條件可同初篩分析測定：定量，注意副產物復篩可進行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株第42頁,共70頁，2024年2月25日，星期天初篩和復篩的比較第43頁,共70頁，2024年2月25日，星期天好氧培養(yǎng)第44頁,共70頁，2024年2月25日，星期天452.2.5復篩高產菌株的分類鑒定菌體形態(tài)特征分析菌體大小、排列、運動性、產芽孢（孢子）特征、產莢膜？鞭毛、菌絲分枝？染色特征生理生化特征分析碳源、氮源、無機鹽、生長因子、產酶反應、藥物敏感性遺傳特征鑒定1、G+C（mol%)（差異>5%可以認為不同種，>10%可以認為不同屬,2、16srRNA的基因序列（同源性>97%認為同種）第45頁,共70頁，2024年2月25日，星期天46舉例：產PGA芽孢桿菌的鑒定細胞形態(tài)特征

菌體大小芽孢形狀芽孢著生位置G+或G-等第46頁,共70頁，2024年2月25日，星期天47生理生化特征第47頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第49頁,共70頁，2024年2月25日，星期天502.2.6培養(yǎng)工藝條件試驗與生產試驗1、搖瓶發(fā)酵條件

培養(yǎng)基組成，初始pH，通風量（裝液量），接種量，培養(yǎng)溫度…2、小型臺式發(fā)酵罐發(fā)酵工藝條件

溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡劑…第50頁,共70頁，2024年2月25日，星期天51培養(yǎng)基配方的獲得單因素試驗多因素試驗（正交試驗）回歸試驗最佳配方的驗證整個發(fā)酵條件的優(yōu)化第51頁,共70頁，2024年2月25日，星期天舉例

碳氮源對Bacillus

subtilis發(fā)酵產PGA的影響

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：L-Glu20g/L，CTA10g/L，NH4Cl4g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，FeCl3?6H2O0.02g/L，K2HPO41g/L，CaCl2?2H2O0.2g/L，MnSO4?H2O0.05g/L,蒸餾水配制，用NaOH調pH7.4，0.1MPa滅菌20min?；景l(fā)酵條件:采用300mL三角瓶，裝液量50mL，無菌培養(yǎng)容器封口膜封口，搖瓶轉速150rpm，種子液種齡24h，接種量4%，37℃振蕩培養(yǎng)96h。第52頁,共70頁，2024年2月25日，星期天初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)第53頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第54頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第56頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第58頁,共70頁，2024年2月25日，星期天枯草芽孢桿菌合成γ-PGA培養(yǎng)基優(yōu)化的回歸試驗設計

對甘油及檸檬酸添加量的優(yōu)化(正交組合設計)選擇因素:Z1——甘油（g/L）,40～120;Z2——檸檬酸（g/L）,4～20

其它發(fā)酵條件為：Glu20g/L，(NH4)2SO47g/L，K2HPO4????3H2O0.7g/L，MgSO4??7H2O0.5g/L，FeCl3?6H2O0.02g/L，CaCl20.25g/L，MnSO4?H2O0.3g/L，pH6.5，裝液量50mL/300mL三角瓶，接種量4%(培養(yǎng)24h種子液)，搖瓶轉速150r/min。取三水平，Z1：40，80，120;Z2：4，12，20。作變換：X1=（Z1-80）/40，X2=（Z2-12）/8試驗方案及試驗結果的分析下表

第59頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第61頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第62頁,共70頁，2024年2月25日，星期天綜合對碳源、氮源及無機離子的優(yōu)化試驗，得到優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（二）：L-Glu20g/L，CTA9.864g/L，Glycerol80.36g/L，(NH4)2SO47g/L，MgSO4?7H2O0.5g/L，FeCl3?6H2O0.0224g/L，K2HPO40.8922g/L，CaCl20.0323g/L，MnSO4?H2O0.3g/L,蒸餾水配置，用NaOH調pH6.5，0.1MPa滅菌20min。基本發(fā)酵條件：采用300mL三角瓶裝液量50mL，種子液24h，接種量4%（v/v）,搖瓶轉速150r/min，37℃振蕩培養(yǎng)96h。第63頁,共70頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共70頁，2024年2月25日，星期天搖瓶水平到反應器水平