實驗五轉基因植物的檢測

關于實驗五轉基因植物的檢測1、檢測外源基因在植物細胞中的轉錄，對外源基因表達調控進行研究，掌握引物的選擇、cDNA的合成、RT-PCR檢測的原理與方法。。實驗目的第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1、材料：轉基因植物的RNA或mRNA制備物。非轉化的植株材料總RNA或mRNA制備物2、設備：PCR儀、移液器、PCR管等。3、試劑：10×RT緩沖液、dNTP、逆轉錄酶、引物（隨機引物，OligodT;特異引物)、10×OneStepRNAPCRBuffer、25mMMgCl2、10mMdNTP、RNaseInhibitor(40U/μl)、AMV-OptimizedTaq1μl、AMVRTaseXL(5U/μl)、上游特異Primer(20μM)*1、下游特異Primer(20μM)*2、RNaseFreeH2O。實驗材料、設備及試劑第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗操作步驟：1）RNA提?。?/p>

關鍵防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟。第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天2、cDNA第一鏈的合成：取1個0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：10×PCRBuffer1μlRNaseFreedH2O5.75μldNTP1μlRNaseInhibitor0.25μlAMVRTaseTranscriptase0.5μloligodT-Adaptorprimer0.5μlRNA1μlTotal10μl實驗步驟第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天反應條件：

42℃30min99℃5min5℃5min第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3、PCR反應取一個0.2ml的PCR管，依次加入下列試劑：

10×PCRBuffer

4μl

滅菌蒸餾水9μl

10mMdNTP２.5μl

Taq酶0.1μl

上游特異Primer(20μM)*1

0.2μl

下游特異Primer(20μM)*2

0.2μl

Total16μl

將（1）的反應結果稀釋20倍，取10μl加入到（2）管中，輕輕搖勻。第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天反應條件：94℃2min94℃30s55℃30s72℃1min72℃7min30Cycles第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天目前研究轉基因植物外源基因轉錄表達的常用方法1、RT-PCR(RNA)

2、Northernblot(RNA)

3、real-timePCR(RNA

）

第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天結果與分析利用凝膠成像分析儀對電泳結果進行拍照和結果記錄；觀察膠上是否有預擴增的主要產物帶。對比目的基因產物的電泳譜帶分子量和譜帶的特異性，確定和描述譜帶特征。

RT-PCR擴增得到的810bp的目的基因產物的電泳結果第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1、將實驗結果粘到實驗報告上。2、如何選擇RT-PCR的反轉錄引物。3、結合實驗結果，試論應用RT-PCR研究外源基因轉錄表達的優(yōu)缺點。實驗報告第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗一、質粒三種提取方法的比較為什么要用對數期的菌液提取質粒？因為對數期菌的生長狀況和數量最佳,有利于提取質粒

溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用？溶液Ⅰ50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液Ⅱ0.2MNaOH/1%SDS破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸鉀/2M醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天溶菌酶的作用作用?沸水加熱的作用?利用溶菌酶和TritonX-100破壞細胞壁,加熱可使蛋白質和染色體DNA變性.將實驗電泳結果粘到實驗報告上，并對結果分析。比較三種提取方法的區(qū)別？第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗二、醋酸鋰法轉化酵母細胞觀察并描述培養(yǎng)狀況，統(tǒng)計單菌落個數。比較酵母細胞轉化與大腸桿菌細胞轉化的區(qū)別。酵母菌屬于真核生物,大腸桿菌是細菌屬于原核生物.酵母轉化在室溫，大腸桿菌轉化在冰上酵母轉化用醋酸鋰，大腸桿菌轉化用氯化鈣酵母轉化用穿梭質粒，大腸桿菌轉化用普通質粒穿梭質粒是指一類人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇標記，因而可以在兩種不同類群宿主中存活和復制的質粒載體。比如說通常能夠在哺乳動物，酵母或者其他細菌復制表達的質粒，同時可以在大腸桿菌內復制。這樣利于對質粒的分子生物學操作和大量制備。第27頁,共29頁，2024年2月25日，星期天實驗三、侵染菌種對除菌抗生素的敏感性頭孢酶素100200300400500600頭孢唑啉鈉------頭孢哌酮鈉------頭孢曲松鈉-++++++++++++++++頭孢噻肟鈉--+++++++++++++-：表示無抑制作用；