特異性抑制人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用的制作方法

特異性抑制人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用的制作方法特異性抑制人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用的制作方法本發(fā)明提供一種特異性抑制人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用，該表達載體是根據(jù)人SIRT1?的mRNA全序列，應用RNAstructure4.4軟件對靶mRNA的序列進行評估得到4條靶核苷酸序列，分別在這4條靶核苷酸序列兩端引入相應的接頭后得到相對對應的shRNA寡核苷酸序列，將shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位點、連結至慢病毒siRNA載體pFIV-H1/U6-copGFP中。所述的多克隆位點包括BbsI酶切位點，正義及反義鏈的5’端分別添加了AAAG?及AAAA，與BbsI酶切后形成的粘性末端互補；本發(fā)明提供的人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體具有轉染效率高，可持續(xù)、穩(wěn)定、特異地抑制人SIRT1基因的表達，可用于科學研究及制備治療人SIRT1基因表達異常相關疾病的藥物?！緦＠f明】特異性抑制人SIRT1基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用【技術領域】[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，尤其涉及特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用?！颈尘凹夹g】[0002]沉默信息調節(jié)因子I(silentinformationregulatorI,SIRT1)是NAD+依賴的蛋白去乙酰化酶,屬于Sirtuin家族,可在哺乳動物中表達主要表達于細胞核,最初定義為NAD依賴的去乙?；讣易?，可使多種蛋白質的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?；是一類進化上高度保守的蛋白質，參與細胞內(nèi)多種生物學事件的發(fā)生，由于SIRTl的作用依賴于NAD+，其作用與機體對氧化和代謝反應有關。研究發(fā)現(xiàn)SIRTl在DNA損傷修復、細胞周期控制、抑制細胞凋亡、有機體的能量代謝、線粒體功能保護、抵抗氧化應激和延長細胞壽命方面起著重要作用。因此SIRTl作為不同疾病治療的靶點，逐漸被人們重視。[0003]但，現(xiàn)有技術中尚無轉染效率高，且可長效穩(wěn)定表達特異抑制人SIRTl基因表達的shRNA表達載體?！景l(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明提供一種特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體及其構建方法與應用，本發(fā)明的SIRTlshRNA慢病毒表達載體具有轉染效率高，可持續(xù)、穩(wěn)定、特異地抑制人SIRTl基因的表達等優(yōu)點，可作為有力工具應用于制備，治療人SIRTl基因表達異常相關疾病的藥物?！0005]本發(fā)明的技術方案是:特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位點；多克隆位點包括BbsI酶切位點，在正義及反義鏈的5’端分別添加了AAAG及AAAA，與BbsI酶切后形成的粘性末端互補；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位點中連結至pFIV-Hl/U6-copGFP表達載體。[0006]所述的shRNA寡核苷酸序列是根據(jù)人SIRTl的mRNA全序列，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應用RNAstructure4.4軟件對祀mRNA的序列進行評估得到4條革巴核苷酸序列，分別在這4條靶核苷酸序列兩端引入相應的接頭后得到相對對應的shRNA寡核苷酸序列。[0007]所述的第一條靶序列Nol:5’-GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列No2為:5’-aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’，所述的反義鏈序列No3為:5’-aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。[0008]所述的第二條靶序列No4:5’-GCTGATGAACCGCTTGCTATC_3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列為No5:5’-aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，所述的反義鏈序列為N06:5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。[0009]所述的第三條靶序列No7:5’-GCTTGATGGTAATCAGTATCT_3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列No8為:5’-aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，所述的反義鏈序列No9為:5’-aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。[0010]所述的第四條靶序列NolO’:5’-GGAGATGATCAAGAGGCAATT_3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列Noll為:5’-aaagGGAGATGATCAAGAGGCAATT-3’，所述的反義鏈序列Nol2為:5’-aaaaAATTGCCTCTTGATCATCTCC-3’。[0011]所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體在制備治療SIRTl基因表達異常相關疾病藥物中的應用。[0012]所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體在制備治療SIRTl基因表達異常，瘢痕疾病藥物中的應用。[0013]shRNA慢病毒表達載體的構建和鑒定:分別合成正義鏈盒和反義鏈，退火后連結至慢病毒siRNA載體pFIV-Hl/U6_copGFP(SystemBiosciences)中，將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養(yǎng)保存并進行PCR鑒定，將初步鑒定結果說明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液進行測序鑒定;shRNA慢病毒表達載體的抽提:將測序結果證實shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液擴增培養(yǎng)，進行大量抽提重組質粒，得到特異抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體。[0014]病毒包裝:將shRNA慢病毒表達載體和慢病毒包裝質?；旌衔锕厕D染293T細胞，轉染后24h使用含I%FBS的DMEM對細胞進行換液處理，轉染48h后收集細胞上清，4000Xg離心5min，然后使用0.45μm的PVDF膜過濾上清液，冰浴保存，測定病毒滴度。[0015]本發(fā)明的優(yōu)點:鑒于由人免疫缺陷病毒(HIV)改構而來的慢病毒載體潛在的生物安全性問題，本發(fā)明選擇由貓免疫缺陷病毒(FIV)改構而來的慢病毒載體pFIV-Hl/U6-COpGFP(SystemBiosciences)構建shRNA慢病毒表達載體。本發(fā)明通過提供的shRNA寡核苷酸序列插入慢病毒的多克隆位點中，靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列，正義及反義鏈的5’端分別添加了AAAG及AAAA，與BbsI酶切后形成的粘性末端互補，最終構建的SIRTlshRNA慢病毒表達載體具有轉染效率高，可持續(xù)、穩(wěn)定、特異地抑制人SIRTl基因的表達等優(yōu)點，可作為有利工具應用于制備，治療人SIRTl基因表達異常相關疾病的藥物。[0016]下面結合附圖和實施例對發(fā)明進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限定?！緦＠綀D】【附圖說明】[0017]圖1為不同shRNA寡核苷酸鏈序列對人增生性瘢痕成纖維細胞SIRTl基因表達的影響；圖2為不同shRNA寡核苷酸鏈序列對人增生性瘢痕成纖維細胞SIRTl基因蛋白表達的影響；圖3為本發(fā)明的載體圖譜?！揪唧w實施方式】[0018]本發(fā)明的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位點；多克隆位點包括BbsI酶切位點，在正義及反義鏈的5’端分別添加了AAAG及AAAA，與BbsI酶切后形成的粘性末端互補；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位點中連結至pFIV-Hl/U6-copGFP表達載體。[0019]所述的ShRNA寡核苷酸序列是根據(jù)人SIRTl的mRNA全序列，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應用RNAstructure4.4軟件對IEmRNA的序列進行評估得到4條祀核苷酸序列，分別在這4條靶核苷酸序列兩端引入相應的接頭后得到相對對應的shRNA寡核苷酸序列。[0020]shRNA慢病毒表達載體的構建和鑒定:分別合成正義鏈和反義鏈，退火后，連結至慢病毒siRNA載體pFIV-Hl/U6_copGFP(SystemBiosciences)中，將連接產(chǎn)物轉化到感受態(tài)大腸桿菌中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養(yǎng)保存并進行PCR鑒定，將初步鑒定結果說明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液進行測序鑒定;shRNA慢病毒表達載體的抽提:將測序結果證實shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液擴增培養(yǎng)，進行大量抽提重組質粒，得到特異抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體。[0021]病毒包裝:將shRNA慢病毒表達載體和慢病毒包裝質?；旌衔锕厕D染293T細胞，轉染后24h使用含1%FBS的DMEM對細胞進行換液處理，轉染48h后收集細胞上清，4000Xg離心5min,然后使用0.45μm的PVDF膜過濾上清液，冰浴保存，測定病毒滴度。[0022]實施例1:人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列的設計在GenBank查找到SIRTl的mRNA全序列(ΝΜ_012238.4|)經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應用RNAstructure4.4軟件對靶mRNA的序列進行評估得到4條靶核苷酸序列，見表1，表1.SIRTl基因的4條特異性siRNA靶核苷酸序列【權利要求】1.特異性抑制人SIRTl基因表達的ShRNA慢病毒表達載體，其特征是:至少包括靶向人SIRTl基因的shRNA寡核苷酸序列和多克隆位點；在人SIRTl基因的shRNA靶序列正義及反義鏈的5’端分別添加了AAAG及AAAA，與多克隆位點BbsI酶切后形成的粘性末端互補；所述的shRNA寡核苷酸序列插入到所述的多克隆位點中連結至pFIV-Hl/U6-COpGFP表達載體。2.根據(jù)權利要求1所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:所述的shRNA寡核苷酸序列是根據(jù)人SIRTl的mRNA全序列，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應用RNAstructure4.4軟件對祀mRNA的序列進行評估得到4條革巴核苷酸序列，分別在這4條靶核苷酸序列兩端引入相應的接頭后得到相對對應的shRNA寡核苷酸序列。3.根據(jù)權利要求2所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:所述的第一條靶序列Nol:5’-GCAACTATACCCAGAACATAG-3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列No2為:5’-aaagGCAACTATACCCAGAACATAG-3’，所述的反義鏈序列No3為:5’-aaaaCTATGTTCTGGGTATAGTTGC-3’。4.根據(jù)權利要求2所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:所述的第二條靶序列No4:5’-GCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列為No5:5’-aaagGCTGATGAACCGCTTGCTATC-3’，所述的反義鏈序列為No6:5’-aaaaGATAGCAAGCGGTTCATCAGC-3’。5.根據(jù)權利要求2所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:所述的第三條靶序列No7:5’-GCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，兩端引入相應的接頭后，所述的shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈和反義鏈序列，所述的正義鏈序列No8為:5’-aaagGCTTGATGGTAATCAGTATCT-3’，所述的反義鏈序列No9為:5’-aaaaAGATACTGATTACCATCAAGC-3’。6.根據(jù)權利要求2所述的特異性抑制人SIRTl基因表達的shRNA慢病毒表達載體，其特征是:所述的第四條靶序列NolO’:5’-GGAGATGATCAAGAGGCAATT-3’，兩端引入相應的