核酸的分離與純化技術(shù)

第三章核酸的分離純化技術(shù)臨床樣本處理與分離純化技術(shù)1臨床樣本的處理2DNA的分離與純化3RNA的分離與純化4自動(dòng)化分離純化系統(tǒng)第一節(jié)臨床樣本的處理核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3’,5’—磷酸二酯鍵連接成的一類生物大分子，包括核糖核酸RNA和脫氧核糖核酸DNA兩類。真核生物原核生物染色體DNA（細(xì)胞核內(nèi)，雙鏈線狀）細(xì)胞器DNA（線粒體或葉綠體，雙鏈環(huán)狀）染色體DNA

（雙鏈環(huán)狀）質(zhì)粒DNA一、臨床樣本處理的一般原則（一）樣本的采集生理活性物質(zhì)容易失活與降解，采集時(shí)要保持取材的新鮮，防止腐敗、變質(zhì)與微生物的污染，按照所需樣本的取材時(shí)間進(jìn)行采集，根據(jù)不同類型的疾病、病程的不同階段以及檢測(cè)方法的要求，收集相應(yīng)的臨床標(biāo)本，最大限度保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。第一節(jié)臨床樣本的處理（二）樣本的運(yùn)送樣本采集后，應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，建議大多數(shù)樣本采集后在2~8℃的低溫條件下運(yùn)送。（三）樣本的保存對(duì)于不能及時(shí)檢測(cè)的樣本，DNA樣本可在2~8℃下保存一周，RNA和蛋白質(zhì)樣本可在-20℃下短期凍存，長(zhǎng)期不用的樣本可以-70℃或液氮中保存。第一節(jié)臨床樣本的處理二、常見臨床標(biāo)本的處理方法1.血液：分子生物學(xué)檢驗(yàn)中常見的臨床樣本，采集前應(yīng)考慮飲食、藥物、采集時(shí)間等因素的影響，取樣時(shí)應(yīng)避免溶血和產(chǎn)生泡沫。包括血清、血漿、全血、血細(xì)胞和無蛋白質(zhì)的血濾液等。2.體液：尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)積液、漿腔膜積液等，離心后收集沉淀用于核酸提取。3.組織：術(shù)后臟器、組織等新鮮材料應(yīng)迅速剝離脂類和結(jié)締組織，用生理鹽水沖洗干凈備用。第一節(jié)臨床樣本的處理4.細(xì)胞：貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞和懸浮細(xì)胞。5.痰液：去除黏蛋白和其他雜質(zhì)。6.棉拭子：呼吸道、消化道和生殖道等標(biāo)本的采集。7.特殊樣本：帶毛囊的毛發(fā)、唾液、牙刷、口香糖、煙蒂、口杯、鼻血、精斑、指甲等。第一節(jié)臨床樣本的處理三、組織細(xì)胞的破碎第一節(jié)臨床樣本的處理破碎細(xì)胞機(jī)械法非機(jī)械法液體剪切法固體剪切法干燥法溶胞法：化學(xué)試劑、酶（方法溫和）不適合真核基因組DNA第二節(jié)DNA的分離與純化臨床檢驗(yàn)中的DNA樣本包括真核生物DNA、細(xì)菌DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA等，結(jié)構(gòu)上有雙鏈環(huán)狀、雙鏈線性和單鏈環(huán)狀。DNA的分離與純化要遵循保證DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整和防止被RNA、蛋白及其他分子污染的原則。簡(jiǎn)化操作步驟，盡量減少對(duì)DNA的破壞。一、基因組DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（一）酚-氯仿抽提法以含EDTA、SDS和RNA酶的裂解緩沖液裂解細(xì)胞，蛋白酶K消化蛋白，然后用酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或異丙醇進(jìn)行沉淀。獲DNA大小為100-150kb。第二節(jié)DNA的分離與純化主要試劑的作用

EDTA：1.二價(jià)金屬離子螯合劑，抑制DNA酶活性；

2.降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。第二節(jié)DNA的分離與純化SDS：陰離子去垢劑1.溶解膜蛋白和脂肪，從而使細(xì)胞膜破裂；2.溶解核膜和核小體，使其解聚，將核酸釋放出來；3.與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性；4.對(duì)RNA、DNA酶有抑制作用。第二節(jié)DNA的分離與純化蛋白酶K：廣譜蛋白酶

水解蛋白質(zhì)的作用，消化DNA酶和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。蛋白酶K與其他蛋白酶相比，它具有更強(qiáng)的水解能力，而且在SDS、EDTA存在時(shí)仍保持較高活性，可同時(shí)使用。第二節(jié)DNA的分離與純化無DNA酶的RNA酶可以有效水解RNA，而避免DNA的消化；酚可以使蛋白質(zhì)變性沉淀、抑制DNA酶活性。在酚或酚-氯仿中加入少許的異戊醇，是可以減少實(shí)驗(yàn)中的氣泡的產(chǎn)生，而且利于分相，保持分相的穩(wěn)定性。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化酚-氯仿抽提法——流程示意圖第二節(jié)DNA的分離與純化能有效變性蛋白質(zhì)，并抑制了DNA酶的降解作用采用實(shí)驗(yàn)室常見的試劑和藥品，成本低。苯酚和氯仿毒性較大，DNA回收率較低，不能進(jìn)行微量操作。第二節(jié)DNA的分離與純化（二）吸附柱法硅基質(zhì)材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高鹽低pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料相結(jié)合，在低鹽高pH值環(huán)境下與硅基質(zhì)材料脫離的特征。其機(jī)理可能是高濃度鹽離子破壞了硅基質(zhì)水分子結(jié)構(gòu)，形成陽離子橋，當(dāng)鹽被清除后，再水化的硅石破壞了基質(zhì)和DNA之間的吸引力，因而DNA從硅基質(zhì)上被洗脫下來。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（三）磁珠法磁珠法的原理是采用納米級(jí)磁珠，表面標(biāo)記了對(duì)DNA有吸附作用的特定活性官能團(tuán)，能同DNA發(fā)生吸附，通過洗滌液洗滌后，加入洗脫液DNA釋放于洗脫液中。同時(shí)可以利用磁珠的磁性可以實(shí)現(xiàn)定向移動(dòng)和聚集，不用離心就可以達(dá)到與雜質(zhì)分離的目的?？梢詫?shí)現(xiàn)高能量和自動(dòng)化。第二節(jié)DNA的分離與純化二、質(zhì)粒DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化細(xì)菌的培養(yǎng)先分離單個(gè)菌落，接種到含少量適當(dāng)抗生素的培養(yǎng)基中擴(kuò)增，隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，質(zhì)粒DNA也在自主復(fù)制。細(xì)菌的收集與裂解質(zhì)粒DNA的分離純化二、質(zhì)粒DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化

常用的堿裂解法，煮沸裂解法，SDS裂解法均可獲得較滿意效果。按制備量的不同質(zhì)粒DNA提取與純化的方法可分為小量制備（1-2ml）、中量制備（20-50ml）和大量制備（500ml）。第二節(jié)DNA的分離與純化（一）堿裂解法簡(jiǎn)單、重復(fù)性好而且成本低，是使用最廣泛的方法在強(qiáng)堿NaOH（pH12.0～12.6）條件下，用SDS破壞細(xì)胞壁和裂解細(xì)胞，并使細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。細(xì)胞裂解后，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的碎片、變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA形成大的復(fù)合物。當(dāng)pH調(diào)至中性，質(zhì)粒DNA重新恢復(fù)天然的超螺旋結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒DNA保留在上清液中。第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化（二）煮沸裂解法將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和溶菌酶的緩沖液中，TritonX-100和溶菌酶能破壞細(xì)胞壁，再用沸水浴裂解細(xì)胞，并使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與DNA變性。質(zhì)粒DNA因結(jié)構(gòu)緊密不會(huì)解鏈，當(dāng)溫度下降后，可重新恢復(fù)其天然超螺旋結(jié)構(gòu)。通過離心去除變性的蛋白質(zhì)和染色體DNA,然后回收上清液中的質(zhì)粒DNA。第二節(jié)DNA的分離與純化煮沸裂解法比較劇烈，只用于提取相對(duì)分子質(zhì)量小(＜15kb)的質(zhì)粒DNA，適用于大多數(shù)E.coli菌株。對(duì)于會(huì)釋放出大量糖類的菌株不適宜。如HB101及衍生菌。不適用于表達(dá)核酸內(nèi)切酶EndA的菌株。第二節(jié)DNA的分離與純化（三）SDS裂解法將細(xì)菌懸浮于等滲的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA處理以破壞細(xì)胞壁用SDS裂解去壁細(xì)胞，溫和釋放質(zhì)粒到等滲液中用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗滌質(zhì)粒DNA適合相對(duì)分子質(zhì)量大(＞15kb)的質(zhì)粒DNA的抽提，但產(chǎn)率不高。三、DNA的鑒定第二節(jié)DNA的分離與純化（一）DNA的濃度鑒定1.紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算DNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×50＝μg/ml紫外分光光度法只用于測(cè)定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA，40μg/ml單鏈DNA或RNA，33μg/ml單鏈寡核苷酸）第二節(jié)DNA的分離與純化第二節(jié)DNA的分離與純化2.熒光光度法熒光染料溴化乙錠EB，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。適用于低濃度核酸溶液的定量分析。1-5ng）致癌、致畸和致突變。第二節(jié)DNA的分離與純化溴化乙錠（EB）第二節(jié)DNA的分離與純化（二）DNA的純度鑒定1.紫外分光光度法通常：純的DNAA260/A280=1.8

污染：DNAA260/A280﹥1.8提示有RNA污染﹤1.8提示有蛋白質(zhì)或酚的污染通過A260

與A280的比值來判定有無蛋白質(zhì)污染和鑒定核酸純度。第二節(jié)DNA的分離與純化2.熒光光度法用EB等熒光染料示蹤核酸電泳，純的DNA分子較RNA大，遷移率低，多于點(diǎn)樣孔附近匯集，可以鑒定DNA制品中有無RNA污染。第二節(jié)DNA的分離與純化RNA第二節(jié)DNA的分離與純化RNA第二節(jié)DNA的分離與純化（三）DNA完整性的鑒定降解：電泳圖呈拖尾狀四、DNA的保存第二節(jié)DNA的分離與純化

短期貯存：-20℃存放于TE（Tris和EDTA）緩沖液中可以保存2年。TE緩沖液的pH與DNA貯存有關(guān)，pH為8.0時(shí)，可減少DNA脫氨反應(yīng)，pH低于7.0時(shí)DNA容易變性。EDTA抵制DNA酶活性。長(zhǎng)期貯存：

TE緩沖液中-70℃保存數(shù)年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。一、RNA提取的特殊要求第三節(jié)RNA的分離與純化RNA酶（RNase）是一類生物學(xué)活性穩(wěn)定的酶類，對(duì)RNA有強(qiáng)烈的降解作用，耐酸、耐堿、耐高溫，蛋白質(zhì)變性劑可使之失活，除去變性劑后又恢復(fù)活性。細(xì)胞內(nèi)、實(shí)驗(yàn)室中的灰塵、各種實(shí)驗(yàn)器皿、人體的汗液及唾液中均含有。第三節(jié)RNA的分離與純化為防止RNase對(duì)RNA的水解，一要全力避免細(xì)胞外RNase的污染并抑制其活性，二要盡快地抑制細(xì)胞內(nèi)RNase的活性并極力地去除RNase。對(duì)廣泛存在的細(xì)胞外RNase，應(yīng)在RNA制備的全過程中保持高度的警惕，并采取嚴(yán)格的措施以避免其污染和抑制其活性。第三節(jié)RNA的分離與純化實(shí)驗(yàn)室保持潔凈戴手套和口罩盡量選用一次性材料及新包裝的化學(xué)試劑，嚴(yán)格洗滌、消毒處理玻璃器皿200℃烘烤2h以上，不能烘烤的用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理。實(shí)驗(yàn)試劑DEPC水處理，高溫高壓滅菌去除DEPC冰浴二、RNA的分離與純化技術(shù)第三節(jié)RNA的分離與純化（一）總RNA的分離與純化1.Trizol試劑法以含異硫氰酸胍、β-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的變性溶液裂解細(xì)胞在pH4.0的條件下，酚-氯仿抽提細(xì)胞裂解溶液通過異丙醇沉淀與75%的乙醇洗滌而獲得總RNA第三節(jié)RNA的分離與純化快速提取總RNA,具有適用范圍廣、操作簡(jiǎn)便、純度高、污染小等特點(diǎn)。第三節(jié)RNA的分離與純化2.離心柱法硅基質(zhì)吸附方法，利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來，釋放出來的核酸特異的吸附在特定的硅載體上，這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力，對(duì)蛋白質(zhì)、多糖、脂類等其他成分基本不吸附，再把吸附在特異載體上的核酸用洗脫液洗脫下來，分離得到純化的總RNA。第三節(jié)RNA的分離與純化可特異吸附核酸,使用方便、快捷，不使用有毒溶劑。第三節(jié)RNA的分離與純化3.磁珠法運(yùn)用納米技術(shù)對(duì)超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和修飾后,制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能與RNA分子特異性地識(shí)別和高效結(jié)合。利用該納米微球的超順磁性,在一定條件下，對(duì)RNA具有極強(qiáng)的富集能力，當(dāng)條件改變時(shí)可逆地釋放RNA,再經(jīng)清洗、洗脫等步驟，可以去除其他雜質(zhì)。第三節(jié)RNA的分離與純化具有高質(zhì)量、高產(chǎn)量、高通量，操作簡(jiǎn)單快速，無毒無害的特點(diǎn)，易于實(shí)現(xiàn)流程自動(dòng)化。第三節(jié)RNA的分離與純化（二）mRNA的分離與純化大多數(shù)真核細(xì)胞的mRNA的3‘-端通常帶有長(zhǎng)短不一的腺苷酸組成的polyA尾巴，以總RNA為起始材料，利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原理，寡聚胸腺嘧啶脫氧核糖核苷（OligoT）可以與之配對(duì)結(jié)合。寡聚（dT）-纖維柱層析法和磁珠法。第三節(jié)RNA的分離與純化1.寡聚（dT）-纖維柱層析法mRNA上的polyA尾巴可與具有OligoT的纖維素柱在高鹽條件下堿基配對(duì)發(fā)生親和吸附，在低鹽條件下，堿基配對(duì)被破壞，吸附解除，而其他成分的RNA不具這一特性。因此在高鹽條件下，當(dāng)RNA抽提樣品經(jīng)流柱體時(shí)，mRNA被掛在柱上，其他RNA隨高鹽溶液流出，當(dāng)用低鹽洗脫液洗柱時(shí)，mRNA被洗脫液流出，再用有機(jī)溶劑沉淀可得到純化的mRNA。第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化2.磁珠法一般用生物素標(biāo)記OligoT，親和素標(biāo)記磁珠，生物素標(biāo)記的OligoT和mRNA上的polyA高效雜交形成復(fù)合體，復(fù)合體可以和親和素標(biāo)記磁珠結(jié)合，用磁性分離架可以將復(fù)合物分離，最后用無Rnase的去離子水將mRNA從復(fù)合物中洗脫出來即可。第三節(jié)RNA的分離與純化第三節(jié)RNA的分離與純化三、RNA的鑒定（一）RNA的濃度鑒定1.紫外分光光度法：測(cè)定DNA在A260nm的光吸收值。如計(jì)算RNA濃度

A260×稀釋倍數(shù)×40＝μg/ml（A值等于1時(shí)，相當(dāng)于40μg/mlRNA）第三節(jié)RNA的分離與純化2.熒光光度法熒光染料溴化乙錠EB，可嵌入到堿基平面，而發(fā)出橙紅熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。第三