微生物基本操作規(guī)范

關(guān)于微生物基本操作規(guī)范主要內(nèi)容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養(yǎng)基的制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6實驗室安全基礎(chǔ)知識第2頁,共166頁，2024年2月25日，星期天§1清洗、消毒和滅菌操作1.1玻璃器皿的清洗

1.1.1新購的玻璃器皿堿性玻璃浸泡于１mol/L鹽酸浸泡過夜，中和玻璃中的堿性物質(zhì)。1.1.2用過的玻璃器皿污染的器皿，必須經(jīng)過適當(dāng)消毒，污跡不能洗凈時，可浸泡于洗液內(nèi)。1.1.3洗液的配制稱取重鉻酸鉀100g與1000mL水置大燒瓶中加熱攪拌溶化，待冷卻后，將燒瓶置冷水中，慢慢加入濃流酸250mL，并不斷攪拌。第3頁,共166頁，2024年2月25日，星期天1.2消毒、滅菌消毒（disinfection）：殺滅物體上病原微生物的方法，但不一定殺死細(xì)菌芽胞。滅菌（sterilization）：殺滅物體上包括芽胞在內(nèi)的所有病原性和非病原性微生物的方法。防腐（antisepsis）：防止或抑制細(xì)菌生長繁殖的方法，細(xì)菌一般不死亡。無菌（asepsis）：不含活菌的意思。防止微生物進(jìn)入機(jī)體或物體的操作方法，稱為無菌操作或無菌技術(shù)。進(jìn)行微生物實驗、外科手術(shù)及醫(yī)療技術(shù)操作等過程，均需進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作。第4頁,共166頁，2024年2月25日，星期天消毒滅菌的方法

（一）物理消毒滅菌法（二）化學(xué)消毒法

第5頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（一）物理消毒滅菌法

1.熱力滅菌法

熱力滅菌法分干熱滅菌和濕熱滅菌兩大類。在同一溫度下，后者效力比前者為大，這是因為：（1）濕熱中細(xì)菌菌體蛋白較易凝固；（2）濕熱的穿透力比干熱大；（3）濕熱的蒸汽有潛熱存在。水由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時釋放出的潛熱，可迅速提高被滅菌物體的溫度。第6頁,共166頁，2024年2月25日，星期天加熱滅菌和加熱消毒的方法

干熱滅菌法

火焰滅菌法干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌巴氏消毒法常壓下煮沸消毒法濕熱滅菌法間歇滅菌法常規(guī)加壓滅菌法加壓下(高壓蒸汽滅菌法)連續(xù)加壓滅菌法第7頁,共166頁，2024年2月25日，星期天干熱滅菌法1.焚燒：是一種徹底的滅菌方法，但僅適用于廢棄物品或尸體等。2.燒灼：直接用火焰滅菌，適用于微生物學(xué)實驗室的接種環(huán)、試管口等的滅菌。3.干烤：鼓風(fēng)干燥箱滅菌。一般加熱至160℃～170℃經(jīng)2小時。適用于高溫下不變質(zhì)、不蒸發(fā)的物品，如玻璃器皿、瓷器等。

第8頁,共166頁，2024年2月25日，星期天濕熱滅菌法1.煮沸法：1個大氣壓下，煮沸的水溫為100℃，一般細(xì)菌繁殖體煮沸5～10分鐘即被殺死。細(xì)菌芽胞常需煮沸1～２小時，才被殺死。水中加入2%碳酸鈉，可提高沸點達(dá)105℃，促進(jìn)細(xì)菌芽胞的殺滅。2.巴氏消毒法（pasteurization）:用較低溫度殺滅液體中的病原菌、同時又不影響消毒物品的營養(yǎng)成分及香味的消毒方法。加熱61.1～62.8℃半小時即可，常用于牛奶和酒類等的消毒。

第9頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.間歇滅菌法（郭霍氏蒸汽消毒）:將待滅菌的物品100℃加熱15～30分鐘，殺死其中的細(xì)菌繁殖體，然后將物品置于37℃溫箱中過夜使芽胞發(fā)育成繁殖體，次日再通過流通蒸汽加熱，如此連續(xù)三次，可將所有細(xì)菌繁殖體和芽胞全部殺死。針對有點培養(yǎng)基和牛奶、糖等在100℃以上有效成分易被破壞的產(chǎn)品進(jìn)行滅菌。

4.高壓蒸汽滅菌法：是滅菌效果最好、目前應(yīng)用最廣的滅菌方法。方法是在一密閉蒸鍋—高壓蒸汽滅菌器內(nèi)進(jìn)行的。通常采用純飽和蒸汽壓為103.4kPa，溫度達(dá)121℃,維持15～30分鐘，可殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物。適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服、耐高溫塑料用品等物品的滅菌。

第10頁,共166頁，2024年2月25日，星期天在高壓蒸汽滅菌前要確保高壓鍋中的所有冷空氣已經(jīng)排空，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對應(yīng)關(guān)系，這樣會大大降低滅菌效果。定期對滅菌效果進(jìn)行監(jiān)測和驗證，可采用：

物理監(jiān)測法（留點溫度計法、熱電偶法）；

化學(xué)指示劑法（化學(xué)指示膠帶、指示卡等）；

生物指示法（孢子懸液、孢子條帶等）監(jiān)控高壓滅菌的效果。第11頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.輻射

利用輻射進(jìn)行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點，所以應(yīng)用越來越廣。1.紫外線：紫外線波長為200～300nm時具有殺菌作用，其中以260nm最強(qiáng)。紫外線殺菌機(jī)理主要是作用于細(xì)菌DNA，使同一條DNA鏈上相鄰的兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合而形成嘧啶二聚體，因而改變DNA的分子構(gòu)型，干擾細(xì)菌DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)菌的死亡或變異。紫外線穿透力差，故只適用于空氣及不耐熱物品的表面消毒。2.應(yīng)用β射線作食品表面殺菌，γ射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使保存期延長。

第12頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.濾過除菌

采用機(jī)械方法，設(shè)計一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)定的體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。

濾過除菌主要用于一些不耐高溫滅菌的血清、毒素、抗生素、藥液、空氣等除菌。但是比細(xì)菌還小的病毒仍然能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的麻煩。

濾菌器的種類很多，目前常用的有蔡氏濾菌器、玻璃濾器、薄膜濾器。

第13頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（二）化學(xué)消毒法

化學(xué)藥物根據(jù)其抑菌或殺死微生物的效應(yīng)分為殺菌劑、消毒劑、防腐劑三類。1.凡殺死一切微生物及其孢子的藥劑稱殺菌劑；2.只殺死感染性病原微生物的藥劑稱消毒劑；3.只能抑制微生物生長和繁殖的藥劑稱為防腐劑。但三者界限往往難以區(qū)分。化學(xué)藥劑的效應(yīng)與藥劑濃度、處理時間長短和菌的敏感性均有關(guān)系，主要仍取決于藥劑濃度。大多數(shù)殺菌劑在低濃度下只起抑菌作用或消毒作用。它們的殺菌或抑菌原理基本相同。實驗室中常用的化學(xué)殺菌劑和消毒劑列于下表。第15頁,共166頁，2024年2月25日，星期天實驗室中常用的化學(xué)殺菌劑和消毒劑第16頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共166頁，2024年2月25日，星期天接種室、培養(yǎng)室空氣熏蒸消毒甲醛熏蒸消毒法（1）加熱熏蒸按熏蒸空間計算，量取甲醛溶液，盛在小燒杯或白瓷坩堝內(nèi)，用鐵架支好，點燃酒精燈，關(guān)閉室門。甲醛溶液煮沸揮發(fā)，酒精燈最好能在甲醛蒸完后即自行熄滅。所需酒精的量要加以控制。（2）氧化熏蒸稱取高錳酸鉀（相當(dāng)于甲醛用量的1/2）于一白瓷坩堝或玻璃燒杯內(nèi)，再量取定量的甲醛溶液，準(zhǔn)備妥當(dāng)后，把甲醛溶液倒在盛有高錳酸鉀的器皿內(nèi)，立即關(guān)門。甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，當(dāng)它與一部分甲醛溶液作用時，由氧化作用產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛溶液揮發(fā)為氣體。甲醛溶液熏蒸后關(guān)門密閉保持12h以上。硫磺熏蒸法稱好硫磺粉，將其放在墊有幾張廢紙或火柴棍的白瓷坩堝或燒杯內(nèi)，點火燃燒，密閉24h，硫磺燃燒前在室內(nèi)墻壁、桌面、地上噴灑些水，使之產(chǎn)生的H2SO3殺菌力增強(qiáng)。為了防止H2SO3和H2SO4對金屬腐蝕，熏蒸前將金屬制品妥善處理。第19頁,共166頁，2024年2月25日，星期天影響消毒滅菌效果的因素

1.消毒劑的性質(zhì)、濃度和作用時間：一般情況下濃度越大，作用時間越長，殺菌效果越好。但95%的乙醇消毒效果反不如75%為好，因為高濃度乙醇使細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)迅速脫水而凝固，影響乙醇進(jìn)入菌體內(nèi)，減弱其殺菌作用。2.微生物的種類與數(shù)量：同種消毒劑對不同微生物的殺菌效果不同。如結(jié)核桿菌對酸、堿的抵抗力比其他的菌強(qiáng)；70%乙醇可殺死一般細(xì)菌繁殖體，但不能殺滅細(xì)菌芽胞。因此，必須根據(jù)消毒對象選擇合適的消毒劑。3.環(huán)境中有機(jī)物的影響：消毒環(huán)境中如有有機(jī)物存在，如血清、膿汁、痰、糞便等，可與消毒劑結(jié)合而影響殺菌效果。

第20頁,共166頁，2024年2月25日，星期天§2培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是指以液體、半固體或固體形式，包含天然或合成成分，用于促進(jìn)微生物的繁殖或保持其活力的物質(zhì)組成。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類很多。我們可根據(jù)某種標(biāo)準(zhǔn)，將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。第21頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.1培養(yǎng)基的分類2.1.1根據(jù)培養(yǎng)基的組成來源不同來區(qū)分:天然培養(yǎng)基;合成培養(yǎng)基;半合成培養(yǎng)基。第22頁,共166頁，2024年2月25日，星期天天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麥芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麩皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等

優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好，來源廣泛.缺點：成分難以確切知道。第23頁,共166頁，2024年2月25日，星期天合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全知道的培養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精確、重復(fù)性強(qiáng)，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，所以它只適用于做一些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。第24頁,共166頁，2024年2月25日，星期天半合成培養(yǎng)基

在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。

這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用最多。

第25頁,共166頁，2024年2月25日，星期天固體培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基；半固體培養(yǎng)基。2.1.2根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分第26頁,共166頁，2024年2月25日，星期天液體培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分基本上溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布均勻，易于控制微生物的生長代謝狀態(tài)。

第27頁,共166頁，2024年2月25日，星期天固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。在實驗室中，它被用作微生物的分離、鑒定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。

第28頁,共166頁，2024年2月25日，星期天半固體培養(yǎng)基把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2～1%之間。這種培養(yǎng)基有時可用來觀察微生物的動力，有時用來保藏菌種。第29頁,共166頁，2024年2月25日，星期天運(yùn)輸培養(yǎng)基；保存培養(yǎng)基；增菌培養(yǎng)基。2.1.3根據(jù)培養(yǎng)基的用途來區(qū)分第30頁,共166頁，2024年2月25日，星期天運(yùn)輸培養(yǎng)基在取樣后和實驗室樣品處理前的時間，保護(hù)和維持微生物活性的培養(yǎng)基（如Stuart或Amies運(yùn)輸培養(yǎng)基）。運(yùn)輸培養(yǎng)基中通常不允許包含使微生物增殖的物質(zhì)，但是培養(yǎng)基應(yīng)能保護(hù)菌株，確保它們不變質(zhì)。第31頁,共166頁，2024年2月25日，星期天保存培養(yǎng)基用于在一定期限內(nèi)保護(hù)和維持微生物活力，以防對微生物在長期保存中產(chǎn)生不利影響，或使微生物在長期保存后容易復(fù)蘇的培養(yǎng)基（如Dorset卵黃培養(yǎng)基）。第32頁,共166頁，2024年2月25日，星期天復(fù)蘇培養(yǎng)基能夠使受損或應(yīng)激的微生物修復(fù)，使微生物恢復(fù)正常生長能力，但不一定促進(jìn)微生物繁殖的培養(yǎng)基。第33頁,共166頁，2024年2月25日，星期天增菌培養(yǎng)基大多為液體培養(yǎng)基，能夠給微生物的繁殖提供較適當(dāng)?shù)纳L環(huán)境，包括：A.選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌體生長的培養(yǎng)基（如SC、LST、RV等）；B.非選擇性增菌培養(yǎng)基：能夠保證大多數(shù)微生物生長的培養(yǎng)基（如M肉湯、營養(yǎng)肉湯）。第34頁,共166頁，2024年2月25日，星期天分離培養(yǎng)基支持微生物生長的固體或半固體培養(yǎng)基，包括：A.選擇性分離培養(yǎng)基：支持特定微生物的生長而抑制其他微生物生長的培養(yǎng)基（如PALCAM瓊脂、TCBS、顯色培養(yǎng)基等）；B.非選擇性分離培養(yǎng)基：對微生物沒有選擇性抑制的分離培養(yǎng)基（如腦心浸液肉湯、營養(yǎng)瓊脂）。第35頁,共166頁，2024年2月25日，星期天鑒別培養(yǎng)基能夠進(jìn)行一項或多項微生物生理學(xué)和生化特性鑒定試驗的培養(yǎng)基（如尿素培養(yǎng)基、Kligler瓊脂等）；能夠用于分離培養(yǎng)的鑒別培養(yǎng)基被稱作分離/鑒別培養(yǎng)基（如XLD、DHL、TCBS等）。第36頁,共166頁，2024年2月25日，星期天鑒定培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生一個特定的鑒定反應(yīng)而不需要做進(jìn)一步確認(rèn)實驗的培養(yǎng)基（如ONPG、氧化酶試劑）。用于分離的鑒定培養(yǎng)基被稱為分離/鑒定培養(yǎng)基（如顯色培養(yǎng)基）。

顯色培養(yǎng)基是在選擇性培養(yǎng)基上加入了適量的帶發(fā)色及熒光基團(tuán)的酶底物，發(fā)色團(tuán)（熒光團(tuán)）與特殊酶可識別的基團(tuán)相連。目標(biāo)微生物產(chǎn)生一些特殊的可水解發(fā)色及熒光底物的酶，使得發(fā)色和熒光基團(tuán)釋放出來，從而使目標(biāo)微生物帶上易于辨別的特殊顏色或發(fā)出熒光。第37頁,共166頁，2024年2月25日，星期天多用途培養(yǎng)基同時具有多種不同用途的特定培養(yǎng)基。例如，血瓊脂是一種復(fù)蘇培養(yǎng)基，又是分離培養(yǎng)基，還可作為溶血實驗的鑒別培養(yǎng)基。第38頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(1)即用型培養(yǎng)基：以即用形式置于容器中（如平皿、試管或其他容器）供應(yīng)的培養(yǎng)基。(2)商品化脫水合成培養(yǎng)基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小顆粒、凍干等形式）培養(yǎng)基。溶于水后能制備成一種或兩種類型的培養(yǎng)基：

a)完全即用型培養(yǎng)基：不需要添加其他成分的培養(yǎng)基；

b)不完全即用型培養(yǎng)基：使用時加入不穩(wěn)定成分。2.1.4根據(jù)培養(yǎng)基的制備方法不同來區(qū)分第39頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.1.5實驗室制備個別成分培養(yǎng)基實驗室按照培養(yǎng)基配方逐一稱取個別成分，按照培養(yǎng)基制備程序進(jìn)行。第40頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.2培養(yǎng)基的制備正確制備培養(yǎng)基是微生物檢驗的一個基本步驟。在處理脫水培養(yǎng)基和其他含有有害物質(zhì)（如膽鹽或其他選擇劑）的培養(yǎng)基時，應(yīng)遵守良好實驗室規(guī)范（GLP）和生產(chǎn)廠商的注意事項。使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時，應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配制，如質(zhì)量（體積）、pH、制備條件、滅菌條件、操作步驟等。當(dāng)使用獨立成分制備培養(yǎng)基時，按配方準(zhǔn)確配制并記錄所有配制步驟。另外，記錄所有使用成分的特性（如代號和批號等）。第41頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（1）水配制培養(yǎng)基應(yīng)使用蒸餾水或相同質(zhì)量的水，目的是排除抑制或影響微生物生長的物質(zhì)。為保證蒸餾水的質(zhì)量，蒸餾水的電阻率最少應(yīng)達(dá)到0.3MΩ/cm。建議不使用未經(jīng)過微生物含量檢測的水（細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于1000CFU/mL）。第42頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（2）稱量和復(fù)水稱量所需的脫水培養(yǎng)基（注意緩慢操作，必要時佩戴口罩或在通風(fēng)櫥中操作，以防吸入含有有毒物質(zhì)的培養(yǎng)基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊），然后再加水至所需的量。第43頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（3）溶解和分裝脫水培養(yǎng)基加水后適當(dāng)加熱，并不停攪拌使其快速溶解，必要時，重新溶解。含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱前應(yīng)先浸泡幾分鐘。由個別成分制備的培養(yǎng)基應(yīng)將不同成分分別加入適量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。第44頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（4）pH的測定和調(diào)整用pH計測pH，必要時進(jìn)行調(diào)整。在實驗室用個別成分制備的培養(yǎng)基，除特殊說明外，培養(yǎng)基滅菌并冷卻到25℃時，培養(yǎng)基的pH變化不應(yīng)超過0.2個pH單位。一般使用大約濃度為40g/L（約1mol/L）氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液進(jìn)行培養(yǎng)基pH的調(diào)整。值得注意的是，商品化的培養(yǎng)基在高壓滅菌前后的pH可能變化很大，但使用質(zhì)量好的蒸餾水或去離子水配制時，滅菌前并不需要調(diào)節(jié)pH。第45頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（4）分裝

將配制好的培養(yǎng)基分裝到適當(dāng)?shù)娜萜髦?，?yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適當(dāng)容器內(nèi)，分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉塞封堵，制作的棉塞應(yīng)緊貼管壁，不留縫隙，以防外界微生物沿縫隙侵入，棉塞不宜過緊或過松，塞好后以手提棉塞，試管不下落為準(zhǔn)。棉塞的2/3在試管內(nèi)，1/3在試管外。第46頁,共166頁，2024年2月25日，星期天分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗干凈并經(jīng)干烤消毒，以利于培養(yǎng)基的徹底滅菌。此外還須用防水紙包扎（目前試管一般多有用螺旋蓋，采用金屬或塑料試管帽），分裝時最好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應(yīng)以能形成2/3底層和1/3斜面的量為恰當(dāng)。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20mL培養(yǎng)基于一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，作為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。第47頁,共166頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。但有些特殊培養(yǎng)基（如嗜鹽瓊脂培養(yǎng)基、MKTTn、科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基等）只能煮沸滅菌。煮沸后應(yīng)迅速冷卻，避光保存；明膠、血清、糖類等不耐高溫的物質(zhì)，應(yīng)采取高壓鍋低溫滅菌法（間歇滅菌法）滅菌；有些試劑不需滅菌，可以直接使用（參見相關(guān)國際標(biāo)準(zhǔn)或供應(yīng)商使用說明）。所有培養(yǎng)基濕熱或過濾滅菌后,必須進(jìn)行監(jiān)測,尤其是要對pH、顏色、無菌效果和均勻性等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測。（6）滅菌第48頁,共166頁，2024年2月25日，星期天制備含有有毒物質(zhì)的添加成分（尤其是抗生素）時，需要特別小心（必要時在通風(fēng)櫥內(nèi)操作），避免因粉末的擴(kuò)散造成實驗人員過敏或發(fā)生其他不良反應(yīng)。制備溶液時要特別小心并按產(chǎn)品使用說明操作，不要使用過期的試劑。對于抗生素工作溶液，應(yīng)當(dāng)現(xiàn)用現(xiàn)配。在特定環(huán)境下，抗生素溶液應(yīng)適量分裝后冷凍儲存，但解凍后的溶液不能再次冷凍，生產(chǎn)廠商應(yīng)提供冷凍對抗生素活性影響的有關(guān)資料，也可由使用者自行測定。（7）添加成分的制備第49頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.3培養(yǎng)基的使用(1)瓊脂培養(yǎng)基的融化將培養(yǎng)基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高壓鍋中的蒸汽）使之融化。經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基盡量減少加熱時間以保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。避免過度加熱，培養(yǎng)基融化后即可將其從加熱器上取下，放入47℃±2℃的恒溫水浴鍋中冷卻，直至使用。融化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用，放置時間一般不應(yīng)超過4h。第50頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(2)培養(yǎng)基的脫氣必要時，將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min，加熱時松開容器的蓋子；加熱后蓋緊蓋子，迅速冷卻至使用的溫度。(3)添加成分的加入對熱不穩(wěn)定的添加成分應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至47℃±2℃時再加入。在加入滅菌的添加成分前，先放置到室溫，避免冷的液態(tài)造成瓊脂凝結(jié)或形成片狀物。將加入培養(yǎng)基的所有添加物緩慢充分混勻，然后盡快分裝到要使用的容器中。第51頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(4)培養(yǎng)基斜面和平板培養(yǎng)基的制備和儲存瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后立即取出，冷至55℃-60℃時，擺置成適當(dāng)斜面，待其自然凝固。斜面長度不超過試管長度1/2為宜。如制作半固體或固體深層培養(yǎng)基時，滅菌后則應(yīng)垂直放置至冷凝。制備平板培養(yǎng)基，將融化的培養(yǎng)基傾注到平皿中，使之在平皿中形成一個至少2mm厚的瓊脂層（對于直徑90mm的平皿，通常需要加入15mL瓊脂培養(yǎng)基）。將平皿蓋好蓋子后放到一個涼的水平平面使瓊脂冷卻凝固。在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基會損失水分，當(dāng)水分損失的量大于培養(yǎng)基總量的15％時，就會影響微生物的生長。第52頁,共166頁，2024年2月25日，星期天凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和（或）放在4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。在平板底部做好標(biāo)記，標(biāo)記的內(nèi)容包括制備日期和（或）有效期和名稱，也可以使用培養(yǎng)基的編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。將倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延長儲存期限。為了避免產(chǎn)生冷凝水，平板應(yīng)冷卻后再裝入袋中。儲存前不要對瓊脂培養(yǎng)基表面進(jìn)行干燥處理。對于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，應(yīng)先對瓊脂表面進(jìn)行干燥；干燥時，將平板蓋揭開，將平板倒扣于烘箱（培養(yǎng)箱）中（溫度設(shè)為20℃～50℃），或放在有對流風(fēng)的無菌凈化臺中，直到培養(yǎng)基表面的水滴消失為止。注意不要過度干燥，商業(yè)化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明操作。第53頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(5)培養(yǎng)培養(yǎng)時每垛最多堆放6個平板，平板間要留有空隙以進(jìn)行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致。對于液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度與培養(yǎng)箱達(dá)到一致取決于很多因素，如體積、內(nèi)容物量、容器類型、培養(yǎng)類型等。在使用厭氧罐時，有時堆放的平板數(shù)可以超過6個。第54頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(6)培養(yǎng)基的棄置所有污染的和未使用的培養(yǎng)基的棄置應(yīng)采用安全的方式，而且要符合國家和地方法規(guī)的規(guī)定。第55頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.4成品的質(zhì)量控制

(1)物理質(zhì)量的控制實驗室測試至少應(yīng)包括以下內(nèi)容：20℃～25℃時的pH；

觀察以下內(nèi)容：加入培養(yǎng)基的量和（或）瓊脂層的厚度；色澤；透明度和（或）是否存在肉眼可見的雜質(zhì)；凝膠穩(wěn)定性（粘稠度）和濕度。第56頁,共166頁，2024年2月25日，星期天(2)微生物指標(biāo)控制A.污染檢測：在每批制備好的培養(yǎng)基選取部分樣品進(jìn)行污染測試。B.測試菌株：具有代表性的穩(wěn)定特征并能有效證明實驗室培養(yǎng)基最佳性能的一套菌株。測試菌株主要購于標(biāo)準(zhǔn)菌株保藏中心，也可以是實驗室自己分離的具有良好特性的菌株。最好使用從事品種分離的菌株。包括：陽性菌株、陰性菌株等。C.即用培養(yǎng)基和試劑：應(yīng)由商品化即用培養(yǎng)基的生產(chǎn)廠，向使用者提供相應(yīng)的資質(zhì)證明。使用者就不必對培養(yǎng)基進(jìn)行大量的培養(yǎng)基測試工作，但應(yīng)保證其儲存條件。第57頁,共166頁，2024年2月25日，星期天D.商品化合成脫水培養(yǎng)基制備的培養(yǎng)基：對于每批制備好的培養(yǎng)基，除用有效菌株進(jìn)行測試外，還應(yīng)用實際樣品進(jìn)行檢測，以更好地證明。不含指示劑的培養(yǎng)基，只需用陽性測試菌株進(jìn)行檢測。含有指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基，應(yīng)使用能證明其指示或選擇作用的菌株進(jìn)行試驗。復(fù)合培養(yǎng)基（即需要加入添加成分的培養(yǎng)基）需要用具備有效性能的菌株逐批進(jìn)行驗證，對實驗室制備的需加入添加成分的現(xiàn)成培養(yǎng)基同樣適用。第58頁,共166頁，2024年2月25日，星期天1.SN/T1538.1-2005培養(yǎng)基制定指南第一部分：實驗室培養(yǎng)基制備質(zhì)量保證通則。2.ISO/TS11133.1-2000食品和動物飼料的微生物學(xué)培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)導(dǎo)則第1部分實驗室培養(yǎng)基制備的質(zhì)量保證一般導(dǎo)則3.SN/T1538.2-2007培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能測試實用指南。本部分標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了培養(yǎng)基的通用質(zhì)量控制要求并列舉了固體和液體培養(yǎng)基的性能測試方法。本部分標(biāo)準(zhǔn)適用于市售和自制培養(yǎng)基的性能測試。第59頁,共166頁，2024年2月25日，星期天§

3.采樣和取、制樣樣品的采樣和取、制樣是食品微生物檢驗的重要組成部分。要得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，必需正確掌握采樣技術(shù)、樣品傳遞、樣品保存方法和樣品的制備技術(shù)，保證樣品在從采樣到制樣整個過程中的一致性。如果樣品的采取、運(yùn)送、保存或制備過程中操作不當(dāng)，或者樣品不具有代表性，就會使實驗室的微生物檢驗結(jié)果毫無意義。對采樣人員和制樣人員提出了很高的專業(yè)要求，既要保證樣品的代表性和一致性，又要保證整個微生物檢驗過程在無菌操作的條件下完成。第60頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.1采樣采樣是指在一定質(zhì)量或數(shù)量的產(chǎn)品中，取一個或多個代表性樣品，用于微生物檢驗的過程。樣品必須對采樣的整個產(chǎn)品或批量具有代表性。樣品的大小應(yīng)能滿足在需要時進(jìn)行重復(fù)分析的需要。第61頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.1.1采樣準(zhǔn)備工作1.采樣工具采樣工具要達(dá)到無菌的要求。對采樣工具和一些試劑材料應(yīng)提前準(zhǔn)備、滅菌。1）開啟容器的工具：剪刀、刀子、開罐器、鉗子等。雙層紙包裹滅菌（121℃，15min），干燥潔凈的環(huán)境中保存2個月。2）樣品采集工具：滅菌的鏟子、勺子、取樣器、鑷子、鋸子、刀子、剪子、壓舌板、木（電）鉆、打孔器、金屬試管和試子等。3）取樣容器：滅菌的廣口瓶或細(xì)口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金屬試管或類似的密封金屬容器。最好不使用玻璃容器，運(yùn)輸中易碎。4）溫度計：-20℃~100℃，溫度間隔1℃。最好使用金屬或電子溫度計。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸鈉（濃度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。第62頁,共166頁，2024年2月25日，星期天5)消毒劑：70%~75%乙醇溶液、中等濃度（100mg/L）次氯酸鈉溶液等。6）標(biāo)記工具：標(biāo)簽紙（不干膠標(biāo)簽紙）、油性或不可擦拭記號筆。7）樣品運(yùn)輸工具：便攜式冰箱或保溫箱。8）天平：最大量程為2000g，感量為0.1g。9）攪拌器和混合器：必要時配備帶有滅菌灌的攪拌器或混合器。10）稀釋液：滅菌的磷酸鹽緩沖液、0.1%蛋白胨水、生理鹽水以及其他稀釋液如腦心浸液肉湯、M肉湯、LB肉湯等。11）防護(hù)用品：對樣品的防護(hù)。即保護(hù)生產(chǎn)環(huán)境、原料和成品等不會在取樣過程中被污染，同樣也保護(hù)樣品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒滅菌（或使用一次性無菌物品)。第63頁,共166頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)根據(jù)不同的樣品特征和采樣環(huán)境，對采樣物品和試劑進(jìn)行事先準(zhǔn)備和滅菌等工作。實驗室的工作人員進(jìn)入車間采樣時，必須更換工作服，避免將實驗室的菌體帶入加工環(huán)境，造成加工過程的污染。第64頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.采樣方案

微生物檢驗的特點是一個以小份樣品的檢測結(jié)果來說明一大批食品衛(wèi)生質(zhì)量，因此，用于分析的樣品的代表性至關(guān)重要，也即樣品的數(shù)量、大小和性質(zhì)對結(jié)果判定產(chǎn)生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學(xué)的采樣方案，其次使用正確的采樣技術(shù)，并在樣品的保存和運(yùn)輸過程中保持樣品的原有狀態(tài)。一般說來，進(jìn)出口貿(mào)易合同對食品采樣量有明確規(guī)定的，按合同規(guī)定采樣；進(jìn)出口貿(mào)易合同沒有具體采樣規(guī)定的，可根據(jù)檢驗的目的，產(chǎn)品及被抽樣品批的性質(zhì)和分析方法的性質(zhì)確定采樣方案。目前的采樣方案多為ICMSF推薦的采樣方案和隨機(jī)采樣方案。無論采取何種方法采樣，每批貨物的采樣數(shù)量不得少于5件。對于需要檢驗沙門氏菌的食品，采樣數(shù)量應(yīng)適當(dāng)增加，最低不少于8件。第65頁,共166頁，2024年2月25日，星期天1)采樣的術(shù)語批量貨物：數(shù)量確定的貨物，品質(zhì)必須均勻一致。抽檢貨物：從批量貨中的一個位置取出的少量貨物?；旌县洏樱簵l件允許，從某一特定批量采樣、混合，即為混合貨樣，亦即大樣。樣品單位：從監(jiān)督總體中抽取用于檢驗的樣品中的單位產(chǎn)品。樣品量：樣品中所包含的樣品單位數(shù)。合格判定數(shù)：在計數(shù)采樣檢查中，對接收批的樣品允許出現(xiàn)的缺陷數(shù)或不合格品數(shù)的上限值，合格判定數(shù)又稱可接受數(shù)。批：一批產(chǎn)品中或特定階段或時間內(nèi)代表相同質(zhì)量樣品的單元數(shù)。第66頁,共166頁，2024年2月25日，星期天隨機(jī)采樣：在一批產(chǎn)品中，每個樣品或單元都有同樣被選擇的機(jī)會。這種采樣方法被稱為隨機(jī)采樣。采樣時常需要查閱隨機(jī)數(shù)字表。代表性樣品：廣義上講是指能夠代表一個批的樣品，而不是僅代表其中的一部分。要獲得代表性樣品需要以下四個條件：確定整批產(chǎn)品的采樣點；建立能夠代表整個產(chǎn)品特征的采樣方法；選擇樣品大?。灰?guī)定采樣的頻率。第67頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2）采樣原則(1)根據(jù)檢驗?zāi)康?、食品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案;(2)應(yīng)采用隨機(jī)原則進(jìn)行采樣，確保所采集的樣品具有代表性;(3)采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染；(4)樣品在保存和運(yùn)輸?shù)倪^程中，應(yīng)采取必要的措施防止樣品中原有微生物的數(shù)量變化，保持樣品的原有狀態(tài)。

第68頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3）采樣方案的類型依據(jù)GB4789.1-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗總則》(1)類型采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設(shè)有n、c和m值，三級采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。第69頁,共166頁，2024年2月25日，星期天

n：同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù)；

c：最大可允許超出m值的樣品數(shù)；

m：微生物指標(biāo)可接受水平的限量值；

M：微生物指標(biāo)的最高安全限量值。

注1：按照二級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個樣品中，允許有≤c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于m值。

注2：按照三級采樣方案設(shè)定的指標(biāo)，在n個樣品中，允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值小于或等于m值；允許有≤c個樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值在m值和M值之間；不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗值大于M值。第70頁,共166頁，2024年2月25日，星期天例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含義是從一批產(chǎn)品中采集5個樣品，若5個樣品的檢驗結(jié)果均小于或等于m值（≤100CFU/g），則這種情況是允許的；若≤2個樣品的結(jié)果（X）位于m值和M值之間（100CFU/g<X≤1000CFU/g），則這種情況也是允許的；若有3個及以上樣品的檢驗結(jié)果位于m值和M值之間，則這種情況是不允許的；若有任一樣品的檢驗結(jié)果大于M值（>1000CFU/g），則這種情況也是不允許的。第71頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（2）各類食品的采樣方案

按相應(yīng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定執(zhí)行。（3）食源性疾病及食品安全事件中食品樣品的采集

由工業(yè)化批量生產(chǎn)加工的食品污染導(dǎo)致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集和判定原則按以上的（1）和（2）執(zhí)行。同時，確保采集現(xiàn)場剩余食品樣品。由餐飲單位或家庭烹調(diào)加工的食品導(dǎo)致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集按GB14938中衛(wèi)生學(xué)檢驗的要求，以滿足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原確證的要求。

第72頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4）ICMSF采樣方案簡介國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICMSF）所建議的采樣計劃是目前世界各國在食品微生物工作中常用的采樣方案。ICMSF提出的采樣基本原則根據(jù)：

a)各種微生物本身對人的危害程度各有不同。b）食品經(jīng)不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來設(shè)定采樣方案并規(guī)定其不同采樣數(shù)。第73頁,共166頁，2024年2月25日，星期天ICMSF的采樣方法

有些實驗室在每批產(chǎn)品中，僅采一個檢樣進(jìn)行檢驗，該批產(chǎn)品是否合格，全憑這個檢樣來決定。ICMSF方法與此不同，它是從統(tǒng)計學(xué)原理來考慮，對一批產(chǎn)品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產(chǎn)品的質(zhì)量而設(shè)定的。ICMSF方法中包括二級法及三級法兩種。二級法只設(shè)有n、с及m值，三級法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數(shù)限量。第74頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（1）二級采樣方案自然界中材料的分布曲線一般是正態(tài)分布，以其一點作為食品微生物的限量值，只設(shè)合格判定標(biāo)準(zhǔn)m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。例如生食海產(chǎn)品魚的副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)為n=5，c=0，m=102，n=5即采樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有菌落數(shù)超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。第75頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（2）三級采樣方案設(shè)有微生物標(biāo)準(zhǔn)m及M值兩個限量如同二級法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內(nèi)的檢樣數(shù)，作為c值，如果在此范圍內(nèi)，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細(xì)菌總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產(chǎn)品中，取5個檢樣，經(jīng)檢樣結(jié)果允許≤3個檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間。如果有3個以上檢樣的菌落數(shù)是在m和M值之間或一個檢樣菌落數(shù)超過M值者，則判定該批產(chǎn)品為不合格品。第76頁,共166頁，2024年2月25日，星期天（3）ICMSF對食品中微生物的危害度分類與采樣方案說明為了強(qiáng)調(diào)采樣與檢樣之間的關(guān)系，ICMSF已經(jīng)闡述了把嚴(yán)格的采樣方案與食品危害程度相聯(lián)系的概念（ICMSF，1986）。在中等或嚴(yán)重危害的情況下使用二級采樣方案，對健康危害低的則建議使用三級采樣方案。ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件三者綜合在一起進(jìn)行食品中微生物危害度分類的。這個設(shè)想是很科學(xué)的，符合實際情況的，對生產(chǎn)廠及消費(fèi)者來說都是比較合理的。下面結(jié)合表1加以說明。第77頁,共166頁，2024年2月25日，星期天表1、ICMSF按微生物的危害度及食品處理進(jìn)行情況分類

注：1.表中“減少”系指食品經(jīng)加熱殺死污染的細(xì)菌。

2.“無變化”系指微生物數(shù)不增減例如冷凍食品或干燥食品。

3.“增加”系指將食品保存在不良環(huán)境中使微生物易于繁殖和產(chǎn)毒。

4.n：一批產(chǎn)品采樣個數(shù)。c：該批產(chǎn)品的樣品菌落數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)。第78頁,共166頁，2024年2月25日，星期天

根據(jù)表1中15種情況的舉例，1-3可用三級法，4-5可用二級法來判定是否合格。

考慮到以上15種情況，分別設(shè)定不同的取樣數(shù)及檢樣污染數(shù)，在1-9例中檢樣需采5個（n=5），而污染檢樣數(shù)設(shè)定為c=3，2，1。在10-15例用二級法則不得檢出該致病菌c=0。例如冷凍食品，細(xì)菌數(shù)按例2，大腸菌按例5，金黃色葡萄球菌按例8，沙門氏菌按例11的二級法判定。

對食品處理應(yīng)酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌所抑制，不易發(fā)生食物中毒，適用例7和例8。烹調(diào)加工后的熟肉，對腐敗菌沒有抵抗力，則易發(fā)生食物中毒，適用例9。加熱鹽腌的火腿，水分活性為0.86以下，金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例9。沙門氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，適用例11，如上所述，應(yīng)根據(jù)各種食品的危害度進(jìn)行設(shè)定。第79頁,共166頁，2024年2月25日，星期天

ICMSF方法是以二級法、三級法和抽樣的概念為基礎(chǔ)，再將微生物的知識加進(jìn)來，則可以提出各種食品的微生物標(biāo)準(zhǔn)。如表2。為了安全，冷凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例1、4、10。冷凍加工蝦，為了不加熱就食，在解凍中有增強(qiáng)危害度的可能性，適用例3、6、9、12，對象微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素，兩者雖菌數(shù)限量是相同的，但情況有所不同，分別適用c=3，c=1，因此不依靠菌數(shù)限量，而用合格率來控制。第80頁,共166頁，2024年2月25日，星期天表2、ICMSF蝦的微生物標(biāo)準(zhǔn)注：n：一批產(chǎn)品采樣個數(shù)。

c：該批產(chǎn)品的檢樣菌數(shù)中，超過限量的檢樣數(shù)，即結(jié)果超過合格菌數(shù)限量的最大允許數(shù)。

m：合格菌數(shù)限量，將可接受與不可接受的數(shù)量區(qū)別開。

M：附加條件，判定為合格的菌數(shù)限量，表示邊緣的可接受數(shù)與邊緣的不可接受數(shù)之間的界限。第81頁,共166頁，2024年2月25日，星期天5）隨機(jī)采樣方案在現(xiàn)場采樣時，可利用隨機(jī)采樣表進(jìn)行隨機(jī)采樣。隨機(jī)采樣表（SN0330-1994《出口食品中微生物檢驗通則》系用計算機(jī)隨機(jī)編制而成，包括一萬個數(shù)字。其使用方法如下：

a.先將一批產(chǎn)品的各單位產(chǎn)品（如箱、包、盒等）按順序編號。如將一批600包的產(chǎn)品編為1、2……600。

b.隨意在表上點出一個數(shù)。查看該數(shù)字所在的行和列。如點在第48行、第10列的數(shù)字上。

c.根據(jù)單位產(chǎn)品編號的最大位數(shù)（如A1，最大為三位數(shù)），查出所在行的連續(xù)列數(shù)字（如A2所點數(shù)為第48行、第10、11和12列，其數(shù)字為245），則編號與該數(shù)相同的那一份單位產(chǎn)品，即為一件應(yīng)抽取的樣品。

d.繼續(xù)查下一行的相同連續(xù)列數(shù)字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的數(shù)字，為608）。該數(shù)字所代表的單位產(chǎn)品為另一件應(yīng)抽取的樣品。

e.依次按A4所述方法查下去。當(dāng)遇到所查數(shù)超過最大編號數(shù)量（如第50行的第10、11和12列的數(shù)字為931、大于600）則舍去此數(shù)，繼續(xù)查下一行相同列數(shù)，直到完成應(yīng)抽樣品件數(shù)為止。第82頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.1.2采樣方法

確定了采樣方案以后，采樣方法對采樣方案的有效執(zhí)行和保證樣品的有效性代表性至關(guān)重要。采樣必須遵循無菌操作程序，采樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應(yīng)當(dāng)高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。采樣全過程中，應(yīng)采取必要的措施防止食品中固有微生物的數(shù)量和生長能力發(fā)生變化。確定檢驗批，應(yīng)注意產(chǎn)品的均質(zhì)性和來源，確保檢樣的代表性。第83頁,共166頁，2024年2月25日，星期天各類食品的采樣方法采樣應(yīng)遵循無菌操作程序，采樣工具和容器應(yīng)無菌、干燥、防漏，形狀及大小適宜。1．即食類預(yù)包裝食品：取相同批次的最小零售原包裝，檢驗前要保持包裝的完整，避免污染。2．非即食類預(yù)包裝食品

：原包裝小于500g的固態(tài)食品或小于500mL的液態(tài)食品，取相同批次的最小零售原包裝；大于500mL的液態(tài)食品，應(yīng)在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達(dá)到均質(zhì)后分別從相同批次的n個容器中采集5倍或以上檢驗單位的樣品；大于500g的固態(tài)食品，應(yīng)用無菌采樣器從同一包裝的幾個不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內(nèi),采樣總量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗的要求。第84頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3．散裝食品或現(xiàn)場制作食品：

根據(jù)不同食品的種類和狀態(tài)及相應(yīng)檢驗方法中規(guī)定的檢驗單位，用無菌采樣器現(xiàn)場采集5倍或以上檢驗單位的樣品，放入無菌采樣容器內(nèi),采樣總量應(yīng)滿足微生物指標(biāo)檢驗的要求。4．食源性疾病及食品安全事件的食品樣品

采樣量應(yīng)滿足食源性疾病診斷和食品安全事件病因判定的檢驗要求。第85頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.2樣品的標(biāo)記和運(yùn)輸應(yīng)對采集的樣品進(jìn)行及時、準(zhǔn)確的記錄和標(biāo)記，采樣人應(yīng)清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點、時間、樣品名稱、來源、批號、數(shù)量、保存條件等信息）。3.2.1樣品的標(biāo)記

（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記。在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。標(biāo)記應(yīng)牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。（2）當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職采樣人員運(yùn)送時，必須封識樣品容器。第86頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.2.2樣品的保存和運(yùn)送

（1）采樣后，應(yīng)將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實驗室檢驗。運(yùn)輸時應(yīng)保持樣品完整。如不能及時運(yùn)送，應(yīng)在接近原有貯存溫度條件下貯存。例如冷凍樣品應(yīng)存放在-15℃以下冰箱或冷藏庫內(nèi)；冷卻和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷卻庫內(nèi)；其他食品可放在常溫冷暗處。（2）運(yùn)送冷凍和易腐食品應(yīng)在包裝容器內(nèi)加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。必要時可于途中補(bǔ)加冷卻劑或冷凍劑。（3）如不能由專人攜帶送樣時，也可托運(yùn)。托運(yùn)前必須將樣品包裝好，應(yīng)能防破損，防凍結(jié)或防易腐和冷凍樣品升溫或融化。在包裝上應(yīng)注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字樣。（4）作好樣品運(yùn)送記錄，寫明運(yùn)送條件、日期、到達(dá)地點及其他需要說明的情況，并由運(yùn)送人簽字。3.2.3.2保存方法聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦的樣品保存方式可作參考。第87頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3樣品的制備3.3.1樣品檢驗

實驗室樣品的制備是微生物檢驗的重要環(huán)節(jié)，是獲得較高準(zhǔn)確性和良好檢驗結(jié)果的基礎(chǔ)。3.3.1.1樣品處理1）實驗室接到送檢樣品后，應(yīng)認(rèn)真核對登記，確保樣品的相關(guān)信息完整并符合檢驗要求。2）實驗室應(yīng)按要求盡快檢驗。若不能及時檢驗，應(yīng)采取必要的措施保持樣品的原有狀態(tài)，防止樣品中目標(biāo)微生物因客觀條件的干擾而發(fā)生變化。3）冷凍食品應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃~5℃不超過18h解凍后進(jìn)行檢驗。第88頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.1.2檢驗方法的選擇GB4789.1-2010要求:1）應(yīng)選擇現(xiàn)行有效的國家標(biāo)準(zhǔn)方法。2）食品微生物檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)中對同一檢驗項目有兩個及兩個以上定性檢驗方法時，應(yīng)以常規(guī)培養(yǎng)方法為基準(zhǔn)方法。3）食品微生物檢驗方法標(biāo)準(zhǔn)中對同一檢驗項目有兩個及兩個以上定量檢驗方法時，應(yīng)以平板計數(shù)法為基準(zhǔn)方法。第89頁,共166頁，2024年2月25日，星期天GB/T4789.17~25-2003中分別規(guī)定了肉與肉制品、乳與乳制品、蛋與蛋制品、水產(chǎn)食品、清涼飲料、調(diào)味品、冷食菜和豆制品、糖果和糕點及果脯、酒類的樣品的制備方法。以上標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用的稀釋劑均為無菌蒸餾水或生理鹽水，大多數(shù)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)也主要使用這兩種稀釋劑，而且對待檢樣品的制備方式相當(dāng)單一。反映出我國相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)比較滯后，缺乏先進(jìn)性，微生物樣品制備的方法在實際應(yīng)用中針對性差，操作性不強(qiáng)。第90頁,共166頁，2024年2月25日，星期天由于食品種類繁多，在實際微生物檢驗中盡可能采用統(tǒng)一的樣品制備方法。對于許多特殊產(chǎn)品，由于產(chǎn)品本身的物理狀態(tài)（如干品、粘稠度高的產(chǎn)品等）、樣品中抑制劑存在（如大蒜制品、洋蔥制品、咸魚等）或酸性等原因，需要采用特殊的樣品制備方法。包括：

1）調(diào)整食品稀釋液的pH至中性；2）對于含高抑制物質(zhì)（成分）的產(chǎn)品（如大蒜制品、洋蔥制品等）或所含微生物受損的產(chǎn)品（如酸性食品、鹽漬食品、干制食品等），使用緩沖蛋白胨水或其他稀釋劑（如D/E中和肉湯、腦心浸液肉湯等）；3）對于低水分活度的食物，需要采取特殊復(fù)水程序；第91頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4）調(diào)整適當(dāng)溫度和靜置時間，以利于可可粉、明膠、奶粉等樣品的懸浮；5）對于來自食物加工或貯存過程中的受損微生物，需要采取特殊復(fù)蘇程序；6）某些產(chǎn)品（如谷物）和（或）目標(biāo)菌（如酵母菌和霉菌）的特殊均質(zhì)程序及均質(zhì)時間；7）對于高脂肪食品，使用表面活性劑（如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80），促進(jìn)懸浮過程中的乳化作用。第92頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.2稀釋液的選擇3.3.2.1常用和特殊稀釋液常用稀釋液包括：0.85%生理鹽水、緩沖蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水、磷酸鹽緩沖溶液、無菌蒸餾水等。特殊稀釋液包括：D/E中和肉湯、LB肉湯、M肉湯等。最合適的稀釋液應(yīng)該通過一系列的試驗得到，所選擇的稀釋液應(yīng)該具有最高的復(fù)蘇率。第93頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.2.2厭氧微生物的稀釋液應(yīng)使用具有抗氧化作用的培養(yǎng)基作為稀釋液。制備樣品懸液時應(yīng)盡量避免氧氣進(jìn)入，使用袋式拍擊式均質(zhì)器。配備一些特殊的樣品防護(hù)措施，如厭氧工作站等。3.3.2.3嗜滲菌和嗜鹽菌的稀釋液20%的無菌蔗糖溶液適用于嗜滲菌計數(shù)；研究嗜鹽菌時，可使用15%無菌的氯化鈉溶液作為稀釋液。第94頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.3不同類型樣品的取、制樣

常用取樣工具包括：均質(zhì)器及均質(zhì)杯、拍擊器及拍擊袋、試管、刻度吸管、微量移液器、玻璃珠、檢測天平、水浴鍋、玻璃棒、酒精燈、鑷子、刀子、電鋸、托盤等。3.3.3.1液體樣品制備液體樣品稀釋液時。用無菌移液管取10mL完全混勻的樣品到帶蓋的無菌玻璃瓶中。加稀釋液至100mL配成體積比為1：10的稀釋液。也可選擇質(zhì)量體積比，取10g完全混勻的樣品加入玻璃瓶，用無菌稀釋液配制成100mL，制成質(zhì)量體積比為1：10的稀釋液。實際操作中，等效于1：10的質(zhì)量比。按常規(guī)方法做進(jìn)一步的稀釋，整個樣品稀釋過程在30min內(nèi)完成。第95頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.3.2小顆粒固體樣品面粉和奶粉等小顆粒固體樣品的初識稀釋液較容易配制。無菌稱取10g樣品加入到容積為100mL的無菌帶蓋玻璃瓶中，加入無菌稀釋液至100mL刻度，配成質(zhì)量體積比為1：10的稀釋液。以30cm的幅度搖動25次。必要時按常規(guī)方法進(jìn)一步稀釋。對高溶解度樣品計數(shù)時必須小心，計數(shù)結(jié)果取決于樣品在稀釋液中的均勻性，而均勻性又與樣品的初識狀態(tài)有關(guān)（常表述為個/g）。要得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，第一個稀釋液的體積是否準(zhǔn)確達(dá)到100mL非常重要。除體積因素外，pH和水活度的變化也必須加以考慮。另外，稀釋液中樣品的轉(zhuǎn)接應(yīng)在30min內(nèi)完成。第96頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.3.3粉末狀樣品檢測表層下面樣品中的細(xì)菌時，應(yīng)至少取10g樣品加入適量的無菌稀釋液，并在適當(dāng)?shù)脑O(shè)備中均質(zhì)。常用的均質(zhì)方法是使用拍擊式均質(zhì)器。將樣品和稀釋液一起放入無菌、耐用、薄而軟的聚乙烯袋中，不接觸均質(zhì)器。均質(zhì)時不會引起樣品溫度升高，較好地保護(hù)了待測樣品。即使是冷凍樣品，均質(zhì)效果也很好。這種方法可用于制備濃度很低的稀釋液。第97頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.3.3.4表面樣品表面樣品取樣后，先放到一定體積（如10mL）的稀釋液中，妥善保存，使樣品保持原始狀態(tài)。檢測時，用適當(dāng)?shù)南♂寗┻M(jìn)行定量稀釋（根據(jù)預(yù)測的污染程度稀釋到所需稀釋度）。檢測后根據(jù)稀釋的倍數(shù)進(jìn)行換算。第98頁,共166頁，2024年2月25日，星期天§4接種、分離純化4.1接種

將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。

第99頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.1.1接種工具1．接種針

2.接種環(huán)

3.接種鉤

4.5.玻璃涂棒

6.接種圈

7.接種鋤

8.小解剖刀

圖4-1

接種和分離工具第100頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.1.2無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。第101頁,共166頁，2024年2月25日，星期天接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應(yīng)盡量短。用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動一邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。

平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的蓋打開一小部分進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時，試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊，試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。第102頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2接種法與純培養(yǎng)的分離技術(shù)含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）。如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于一個親代細(xì)胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pureculture）。在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。

第103頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2.1平板劃線分離培養(yǎng)法

平板劃線分離培養(yǎng)法，用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線，使培養(yǎng)物中混在的多種細(xì)菌在培養(yǎng)基表面分散生長，各自形成菌落，根據(jù)菌落的形態(tài)及特征，挑選單個菌落，經(jīng)過移種而獲得純種細(xì)菌（純培養(yǎng)）。分離細(xì)菌的方法很多，最常用的是平板劃線分離法。根據(jù)劃線的方式不同有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖4-2）

第104頁,共166頁，2024年2月25日，星期天圖4-2平板劃線分離法

1.斜線法

2.曲線法

3.方格法

4.放射法

5.四格法

第105頁,共166頁，2024年2月25日，星期天1.曲線劃線分離法1)先將接種環(huán)火焰滅菌,待冷后取培養(yǎng)物少許;2)左手拿起平板，以中指為支點，并用拇指和食指將平板蓋打開；3)右手迅速將取有培養(yǎng)物的接種環(huán)從打開的空間插入平板內(nèi)，使接種環(huán)與培養(yǎng)基表面呈45℃角，在酒精燈上方5~6cm處劃線接種。先在平板上1/5處輕輕涂布，然后即可左右來回以曲線形式作連續(xù)劃線接種，線與線間留有適當(dāng)距離，將整個平板表面劃滿曲線；4)注明標(biāo)識后，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在18~24小時后觀察結(jié)果。第106頁,共166頁，2024年2月25日，星期天2.斜線(分區(qū))劃線分離法1)用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線,再在2、3……區(qū)依次劃線。2)每劃完一個區(qū)域，均將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域。3)每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1~2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落。4)其他操作與上述曲線劃線分離法相同。第107頁,共166頁，2024年2月25日，星期天斜線接種示意圖第108頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第109頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第110頁,共166頁，2024年2月25日，星期天3.方格劃線法

將培養(yǎng)物涂布于平板上1/5處，接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌后，自1/5劃線處作平行劃線5~6條，將接種環(huán)滅菌后，劃垂直線5~6條，使呈正方形格。其他操作同前。第111頁,共166頁，2024年2月25日，星期天

細(xì)菌在固體培養(yǎng)基表面只能在固定的地方生長繁殖，經(jīng)過一定的培養(yǎng)時間后，可形成肉眼可見的菌落。菌落中只含有一種細(xì)菌，而每種細(xì)菌的菌落各有其特征。菌落形態(tài)往往有助于初步識別細(xì)菌；還可以由此獲得細(xì)菌而進(jìn)行一系列的鑒定。

識別菌落的能力是從事微生物檢驗人員的極為重要的基本功。第112頁,共166頁，2024年2月25日，星期天菌落形態(tài)觀察1)大小:以mm表示。菌落的大小隨細(xì)菌種類、培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間等條件而不同。同一種細(xì)菌在同一平板上，在密集處的菌落比疏散處小。因此，表示菌落大小時，應(yīng)注明培養(yǎng)基名稱。一般以培養(yǎng)18~24小時后，選散在處的菌落大小。1mm左右為小菌落；2~3mm為中等大；3mm以上為大菌落。2)形狀及邊緣：圓形、不規(guī)則、放射狀、樹根狀、邊緣整齊、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等。3)隆起：平的、突起的、凸面的、凸形的等。4)表面：光滑（S型）、粗糙（R型）；有無光澤等。第113頁,共166頁，2024年2月25日，星期天第114頁,共166頁，2024年2月25日，星期天

圖4-3細(xì)菌的培養(yǎng)特征1.點狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起9.凸起10.墊狀11.臍狀

12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲狀17.卷發(fā)狀

18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假根狀24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹼狀37.膜狀第115頁,共166頁，2024年2月25日，星期天5)構(gòu)造:均勻、露滴狀、顆粒狀、發(fā)狀、皺招狀等。6)顏色：無色、白色、灰色、灰白色或乳白色、熒光綠、金黃色、檸檬色、紅色等、7)透明度：透明、半透明、不透明、微透明等。8)硬度：硬、軟、干燥、濕潤，是否附著于培養(yǎng)基上或嵌入培養(yǎng)基內(nèi)不易刮取。9)質(zhì)地：脂狀、粘液狀、膜狀等。10)乳化性：在鹽水中研磨是否形成均勻乳劑或顆粒狀。11)溶血性：在血平板上，菌落周圍有無溶血環(huán)。第116頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2.2斜面接種法主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個菌落的移種，以及觀察細(xì)菌的某些培養(yǎng)特征。

以菌種移種為例，其接種方法是：1.取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側(cè)面，使菌種管位于外側(cè)，培養(yǎng)基管位于內(nèi)側(cè)。2.右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞。火焰滅菌接種環(huán)。3.以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內(nèi)管），將兩管口迅速通過火焰1~2次。第117頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端。5.取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內(nèi)管）；最后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好。6.做好標(biāo)識，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。第118頁,共166頁，2024年2月25日，星期天圖4-4斜面接種時的無菌操作

(1)接種滅菌

(2)開啟棉塞

(3)管口滅菌

(4)挑起菌苔

(5)接種

(6)塞好棉塞

第119頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2.3液體接種法1.如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管。2.滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調(diào)和，使細(xì)菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以18~24小時培養(yǎng)后觀察生長特征。

肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項：

a.發(fā)育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛。

b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長。c.沉淀:有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）。

d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）。

e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產(chǎn)酸和有無氣體。

第120頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2.4穿刺接種法多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細(xì)菌的某些生化反應(yīng)。1.如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管。2.以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達(dá)近管底部（但不能完全刺到管底），接種針應(yīng)沿原路退出。3.經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮表示細(xì)菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴(kuò)散生長，或整個培養(yǎng)基混濁表示細(xì)菌有動力。第121頁,共166頁，2024年2月25日，星期天4.2.5傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量（1mL）的稀釋液加入已熔化并冷卻至45~50℃的15mL（使用直徑90mm的平皿時）普通瓊脂管中，立即搖勻，趁瓊脂未凝固前傾注于已滅菌的平皿中，待凝固之后，將平板倒置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（圖4-5a）

培養(yǎng)后觀察，細(xì)菌大部