實驗九細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)反應(yīng)觀察部分

關(guān)于實驗九細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)反應(yīng)觀察部分實驗?zāi)康暮蛢?nèi)容了解細(xì)菌生理生化反應(yīng)原理，掌握細(xì)菌鑒定中常用的生理生化反應(yīng)的測定方法；通過不同細(xì)菌對不同含碳、含氮化合物的分解利用情況，了解細(xì)菌碳、氮代謝類型的多樣性；了解細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的不同生長現(xiàn)象及其代謝產(chǎn)物在鑒別細(xì)菌中的意義；第2頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器,材料和用具實驗儀器37℃恒溫培養(yǎng)箱、20℃恒溫培養(yǎng)箱（室溫代替）。微生物材料大腸桿菌、枯草桿菌這二種菌種的斜面各1支。試劑甲基紅試劑、V．P試劑、吲哚試劑、格里斯試劑(硝酸鹽利用試驗)、盧戈氏碘液(淀粉水解試驗)第3頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器,材料和用具實驗用具試管：每份每個試驗2支試驗，7個試驗共14支。無菌平皿：每份2個杜氏小管：每份4個。接種環(huán)、酒精燈、試管架、記號筆。第4頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗儀器,材料和用具培養(yǎng)基葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基甲基紅(葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基)V.P試驗(葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基)檸檬酸鹽利用試驗（檸檬酸鹽利用試驗）吲哚試驗(蛋白水培養(yǎng)基)淀粉培養(yǎng)基第5頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗原理－－細(xì)菌生化試驗糖(醇)類發(fā)酵試驗不同的細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖(醇)的酶，因而發(fā)酵糖(醇)的能力各不相同。其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物亦不相同，如有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生可利用指示劑來判定。在配制培養(yǎng)基時預(yù)先加入溴甲酚紫[pH5.2(黃色)一6.8(紫色)]，當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。氣體產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的杜氏小管中有無氣泡來證明。第6頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟糖(醇)類發(fā)酵試驗編號在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱，所接種的菌名和組號，下同。接種取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基2支，按編號1支接種大腸桿菌，另1支接種枯草桿菌。同樣取2支乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，1支接種大腸桿菌，1支接種枯草桿菌。在接種后，輕輕搖動試管，使其均勻，防止導(dǎo)致的德漢氏/杜氏小管進(jìn)入氣泡。將已接種好的培養(yǎng)基置37℃溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果：被檢細(xì)菌若能發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖時，則使培養(yǎng)基的pH降低，這時培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng)(為黃色)，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則培養(yǎng)基不僅顯酸色反應(yīng)，并且在培養(yǎng)基中倒置的小玻璃管(杜氏小管)中有氣體。氣體占整個倒置小玻管的10％以上。若被檢細(xì)菌不分解培養(yǎng)基中的糖，則培養(yǎng)基不發(fā)生變化。第7頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗結(jié)果糖發(fā)酵實驗Carbohydratefermentation第9頁,共32頁，2024年2月25日，星期天IMViC試驗吲哚試驗甲基紅試驗伏-普（V.P）試驗檸檬酸鹽利用試驗

(Indoltest)(Methylredtest)(Voges-Prokauertest)(Ciratetest）第10頁,共32頁，2024年2月25日，星期天甲基紅(Methylred)試驗(簡稱MR試驗)很多細(xì)菌，如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的pH降低到4.2以下，這時若加甲基紅指示劑呈現(xiàn)紅色。因甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4(紅色)～pH6.2(黃色)。若某些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但很快將丙酮酸脫羧，轉(zhuǎn)化成醇等物，則培養(yǎng)基的pH仍在6.2以上，故此時加入甲基紅指示劑，呈現(xiàn)黃色。實驗步驟第11頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟甲基紅試驗(MR試驗)將大腸桿菌和枯草桿菌分別接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，加甲基紅指示劑2滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。第12頁,共32頁，2024年2月25日，星期天MethylRedTest第13頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共32頁，2024年2月25日，星期天V.P試驗測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸。丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧生成乙酰甲基甲醇，該物質(zhì)在堿性條件下被空氣中的氧氣氧化成二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸中的胍基作用生成紅色化合物。第15頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟伏-普二氏試驗(V.P試驗)

將被檢菌接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，取出，倒掉一半培養(yǎng)液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（總體積）等量的5％

-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃水浴鍋中保溫15～30min，以加快反應(yīng)速度。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏－普反應(yīng)陽性。第16頁,共32頁，2024年2月25日，星期天Voges-ProskauerTest第17頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第18頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗原理－－有機酸鹽及氨鹽利用試驗檸檬酸鹽利用試驗檸檬酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中檸檬酸鈉為碳的唯一來源。而磷酸二氫銨是氮的唯一來源。有的細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，能利用檸檬酸鈉為碳源，因此能在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鹽后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。此時培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑（PH＜6.0時呈黃色，PH在6.0~7.0時為綠色，PH＞7.6時呈藍(lán)色）由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。不能利用檸檬酸鹽為碳源的細(xì)菌，在該培養(yǎng)基上不生長，培養(yǎng)基不變色。第19頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟檸檬酸鹽利用試驗取少量被檢菌接種到檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，觀察結(jié)果。培養(yǎng)基變深藍(lán)色者為陽性。培養(yǎng)基不變色，則繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基仍不變色者為陰性。第20頁,共32頁，2024年2月25日，星期天CitrateTest第21頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗原理靛基質(zhì)(吲哚)試驗?zāi)承┘?xì)菌，如大腸桿菌，能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)(吲哚)，靛基質(zhì)與對二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰色靛基質(zhì)(紅色化合物)。第22頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟靛基質(zhì)(吲哚)試驗將被檢菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h～48h后，加入10-20滴乙醚，振蕩數(shù)次，靜置1－3分鐘，沿試管壁滴加2滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)黃色者為陰性。第23頁,共32頁，2024年2月25日，星期天IndoleTest第24頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第25頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗原理－－大分子物質(zhì)代謝實驗

淀粉水解試驗細(xì)菌對大分子的淀粉不能直接利用，須靠產(chǎn)生的胞外酶(淀粉酶)將淀粉水解為小分子糊精或進(jìn)一步水解為葡萄糖(或麥芽糖)，再被細(xì)菌吸收利用，細(xì)菌水解淀粉的過程可通過底物的變化來證明，即用碘測定不再產(chǎn)生藍(lán)色。第26頁,共32頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟淀粉水解試驗將配制好的淀粉培養(yǎng)基冷卻到50℃左右，以無菌操作制成平板。用接種環(huán)取少許枯草桿菌劃線接種在平板的一邊，再取少許大腸桿菌劃線接種在平板的另一邊。置37℃溫箱培養(yǎng)24h。滴加少量盧戈氏碘液于平板上，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明該菌水解淀粉能力的大小。第27頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3號管--甲基紅試驗:加甲基紅指示劑2滴，觀察結(jié)果，呈現(xiàn)紅色者為陽性，呈現(xiàn)黃色者為陰性。4號管--伏-普二氏試驗:倒掉一半培養(yǎng)液，加入40％KOH5～10滴，然后再加入（總體積）等量的5％

-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃水浴鍋中保溫15～30min。若培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，為伏－普反應(yīng)陽性。6號管--吲哚試驗:加入10-20滴乙醚，振蕩數(shù)次，靜置1－3分鐘，沿試管壁滴加2滴吲哚試劑于培養(yǎng)物液面，出現(xiàn)紅色者為陽性，出現(xiàn)黃色者為陰性。平板--淀粉水解試驗:滴加少量盧戈氏碘液于平板上，使碘液均勻鋪滿整個平板。如菌苔周圍有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小，說明