編碼黑曲霉羧肽酶的基因的制作方法

編碼黑曲霉羧肽酶的基因的制作方法專利名稱：編碼黑曲霉羧肽酶的基因的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及編碼真菌液泡蛋白酶的基因。特別是本發(fā)明涉及絲狀子囊菌類或半知菌類真菌，例如曲霉屬的羧肽酶基因。真菌液泡是含有許多水解酶，包括數(shù)種蛋白酶的酸性器官，并且基本上等同于哺乳動(dòng)物的溶酶體。已經(jīng)鑒定并表征了特別是酵母的一種或多種真菌的水解酶；這些包括蛋白酶A(PEPA或PrA)，蛋白酶B(PrB)或氨肽酶(APE)，二肽基氨肽酶B(DPAPB)，羧肽酶Y(CPY)和羧肽酶S(CPS)。大多數(shù)液泡水解酶是作為非活性前體而合成的糖蛋白。事實(shí)上，除APE外，上述所有提到的蛋白酶都有導(dǎo)致過渡通過分泌途徑的信號(hào)肽。在晚期高爾基體中，液泡蛋白與分泌蛋白分開，然后最終輸送到液泡中。除信號(hào)肽外，大多數(shù)液泡蛋白還含有輸送到液泡后被裂解以產(chǎn)生成熟活性酶的原肽。已經(jīng)證實(shí)在原肽中存在PrA和CPY對(duì)于以液泡為靶所需的氨基酸信息(Johnsonetal.，Cell48875-885，1987；Rothmanetal.，PNASUSA833248-3252，1989；Vallsetal.，Cell48887-897；Vallsetal.J.CellBiol.111361-368，1987)。對(duì)于CPY，已經(jīng)表明有四個(gè)氨基酸殘基(QRPL)對(duì)于定位于液泡是必需的(Vallsetal.J.CellBiol.111361-368，1990)。一旦輸送到液泡后，蛋白酶A(pep4)裂解CPY和PrB的原肽以便激活蛋白酶(Ammereretal.，Mol.Cell.Biol.62490-2499，1986；Woolfordetal.，Mol.Cell.Biol.62500-2510)。在啤酒酵母中，已鑒定了錯(cuò)定位或錯(cuò)分類液泡蛋白的三類突變體(Bankaitisetal.，PNASUSA839075-9079，1986；Robinsonetal.，Mol.Cell.Biol.，84936-4948，1988；Rothmanetal.，EMBOJ.82057-2065，1989；RothmanandSteven，Cell471041-1051，1986)。這些突變體被稱為vps或液泡蛋白分類突變體。利用一種選擇來分離數(shù)個(gè)這樣的突變體，所述選擇是基于觀察到質(zhì)粒上的高拷貝液泡蛋白酶的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致分泌液泡蛋白酶(Stevenetal.，J.CellBiol.，1021551-1557，1986Rothmanetal，PNASUSA833248-3241，1986)。這表明在晚期高爾基體中可能有飽和分類機(jī)制。在啤酒酵母中，還表明，缺失PEP4，CPY和PrB的菌株由于所需產(chǎn)物蛋白水解的減少生產(chǎn)較高水平的異源蛋白質(zhì)。因此，由于生產(chǎn)所研究的液泡蛋白酶的真菌被用于重組生產(chǎn)異源蛋白，因而從商業(yè)角度看，所述液泡蛋白酶是很重要的。在發(fā)酵中這些蛋白酶的存在是很令人頭痛的，因?yàn)樗鼈冞€可以降解所需的蛋白質(zhì)，從而明顯降低生產(chǎn)率。通過破碎或缺失編碼其的基因可以有利于消除任何已有蛋白質(zhì)的功能；但是，這樣做首先要鑒定并分離在所需宿主中的相應(yīng)的基因。如上所述，從各種酵母菌株中只鑒定了很少的所述基因；然而，在絲狀子囊菌或半知菌中編碼液泡蛋白酶的基因很少有人知道。例如，已經(jīng)分離了編碼另兩種黑曲霉液泡蛋白酶的PEPC(Frederichetal.，Gene12557-64，1993)和PEPE(Jaraietal.，Gene145171-178，1994)基因。PEPC編碼蛋白酶B(PrB)同系物，PEPE編碼蛋白酶A的同系物。也已經(jīng)克隆了編碼PrA同系物的NeutosporaCrassa的PEP4基因(Bowman，17thfunga；GeneticsConference，1993)。本文首次描述了來自絲狀子囊菌或半知菌的編碼液泡CPY的基因。本發(fā)明涉及含有編碼絲狀子囊菌或半知菌羧肽酶Y的核酸構(gòu)建體，以及重組生產(chǎn)由其編碼的蛋白質(zhì)。如本文所用的，“核酸構(gòu)建體”指任何cDNA，基因組DNA，合成的DNA或RNA源的核酸分子。術(shù)語“構(gòu)建體”指核酸片段，所述核酸片段可以是單鏈或雙鏈的，可以從天然基因中完全或部分地被分離，或可以被修飾以含有以在自然界不存在的方式組合且并置的DNA片段。所述構(gòu)建體還可以含有其他核酸片段。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述序列編碼曲霉屬的羧肽酶。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)不產(chǎn)生羧肽酶的絲狀子囊菌或半知菌細(xì)胞的方法，包括破碎或缺失羧肽酶基因以防止功能酶的表達(dá)，或通過利用物理或化學(xué)處理的經(jīng)典誘變以產(chǎn)生其生產(chǎn)CPY能力降低或沒有了的細(xì)胞。另外，本發(fā)明還包含不能生產(chǎn)功能羧肽酶或以相對(duì)于野生型菌株生產(chǎn)的量而言，生產(chǎn)減少量的羧肽酶的絲狀子囊菌或半知菌。所述生物提供了改進(jìn)重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法的基礎(chǔ)，其中用編碼所述蛋白質(zhì)的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化羧肽酶缺陷型微生物，然后在表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)。附圖描述圖1表示黑曲霉Bo-1基因組CPY克隆的DNA序列及其翻譯。圖2表示黑曲霉SFAG2CPYcDNA的DNA序列及其翻譯。標(biāo)明了信號(hào)肽酶裂解的預(yù)期的位點(diǎn)以及成熟CPY的N-末端。圖3說明了在破壞CPY中所用的構(gòu)建體。利用啤酒酵母CPY，微紫青霉羧肽酶S1(Svedsenetal.，F(xiàn)EBS33339-43，1993，和麥芽羧肽酶-MIII(Sorensenetal.，Carlsbergres.Commun.54193-202，1993)，通過設(shè)計(jì)一系列的簡(jiǎn)并寡核苷酸來開始嘗試分離曲霉屬羧肽酶Y。下文實(shí)施例中提供了所述寡核苷酸序列。在利用黑曲霉菌株Bo-1基因組DNA為模板的PCR反應(yīng)中，用這些序列以各種組合為引物。其中的兩個(gè)反應(yīng)(用引物1-1和2-1；以及1-2和2-2)產(chǎn)生了一個(gè)1100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將其亞克隆并測(cè)序，但是沒有亞克隆與鑒定為所需基因的CPY明顯同源。然后進(jìn)行了用引物3-1，3-2，4-1，4-2，2-1和2-2的其他PCR反應(yīng)。在其中的兩個(gè)反應(yīng)中(用引物4-1和2-1；以及4-2和2-1)得到了一個(gè)600bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。將該產(chǎn)物亞克隆，并將11個(gè)亞克隆測(cè)序；其中的9個(gè)亞克隆是一致的，而且與其他來源的羧肽酶Y基因同源。用一個(gè)亞克隆中的插入片段探測(cè)黑曲霉基因組DNA；用BamhI，HindIII，和SAlI消化產(chǎn)物觀察到有一個(gè)帶的雜交，表明在黑曲霉中存在單個(gè)CPY基因。于65℃，在1.5×SSPE，1.0％SDS，0.5％脫脂牛奶和200μg/ml鮭精子DNA中進(jìn)行雜交。制備在EMBL4中的黑曲霉基因組DNA庫，然后用PCRCPY-衍生的基因片段(32P-標(biāo)記的)檢測(cè)，以便分離全長(zhǎng)基因。在約28,000個(gè)噬菌體中，撿出11個(gè)陽性的；將其中的9個(gè)在純化后再用探針雜交。大多數(shù)這些克隆共有的5.5HindIII片段被鑒定為黑曲霉CPY基因。將該片段亞克隆并測(cè)序；在圖1中提供了含有CPY編碼區(qū)和預(yù)期的氨基酸序列的片段的序列。隨后，再篩選來自不同黑曲霉菌株的cDNA庫。從該庫中還鑒定至少一個(gè)全長(zhǎng)克隆。將該克隆測(cè)序并在圖2中描述了所述序列。預(yù)期均有兩個(gè)557個(gè)氨基酸長(zhǎng)的CPY前體序列。以與來自啤酒酵母的同源基因的比較為基礎(chǔ)，來自黑曲霉的CPY似乎有一個(gè)137或138個(gè)氨基酸的前-原肽。所述基因含有一個(gè)61個(gè)堿基對(duì)的內(nèi)含子。兩個(gè)黑曲霉序列的比較表明，在氨基酸序列方面有些不同，這可能反映了所述基因組的和cDNA克隆是分離自不同的菌株。與啤酒酵母和C.albican的相應(yīng)的CPY基因的比較表明分別有65％和66％的一致性。本發(fā)明并不限于使用圖1和2所公開的序列。首先，本發(fā)明還包括生產(chǎn)與圖1或2中描述的氨基酸序列相同的，但是因遺傳密碼簡(jiǎn)并性而不同的核苷酸序列。另外，因相同種的兩個(gè)菌株而得到不同的氨基酸序列說明在一個(gè)種內(nèi)的序列上的變異是可以容忍的，而且利用本文描述的技術(shù)，可以很容易鑒定所述的變異體。因此在本文中提到“黑曲霉”時(shí)，應(yīng)理解包括所有所述的變異體。具體地說，本發(fā)明還包括任何變異體核苷酸序列，及由其編碼的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)保留了與圖1或2中所示的氨基酸序列至少約80％，優(yōu)選約85％，最佳為至少約90-95％的同源性，而且在性質(zhì)上保留了本文所述序列的活性。在上述定義的目錄中有用的變異體包括例如，已完成的保守氨基酸取代，所述取代并未顯著影響所述蛋白質(zhì)的活性。所謂保守取代指相同類型的氨基酸可以由該類型的其他氨基酸取代。例如，可以交換非極性的脂肪族殘基Ala，Val，Leu，和Ile，堿性殘基Lys和Arg，或酸性殘基Asp和Glu。相似地，Ser和Thr彼此可以進(jìn)行保守取代，Asn和Gln也可以。另外，分離的基因提供了從其他絲狀子囊菌或半知菌，例如曲霉種，如米曲霉，臭曲霉，日本曲霉，棘孢曲霉，或構(gòu)巢曲霉中分離同源基因的方法。其他非曲霉絲狀子囊菌包括鐮孢屬，例如，禾谷鐮孢，尖孢鐮孢，茄病鐮孢大刀鐮孢(或相應(yīng)的teleomorphs)粗糙鏈孢霉，Trichodermareesei，Tviridae，T.harzianumT.longibranchiatum，微紫青霉，點(diǎn)青霉，產(chǎn)黃青霉，沙門氏柏干酪青霉，婁格法兒特氏青霉，Humicolainsolen，灰色腐質(zhì)霉thermoidea變種，H.lanuginosa，Scytalidiumthermophilumyceliophthorathermophila，和Thielaviaterrestris。在Southern雜交中可以用所述基因或以其為基礎(chǔ)的寡核苷酸作探針，以分離這些其他種中的同源基因。具體地說，用所述探針在低或高嚴(yán)謹(jǐn)條件下(例如，在42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切并變性的鮭精DNA，分別為50，35或25％用于高，中和低嚴(yán)謹(jǐn)條件下預(yù)雜交和雜交)與所需種的基因組或cDNA進(jìn)行雜交，標(biāo)準(zhǔn)的Southerm印跡方法后，以鑒定并分離其中相應(yīng)的CPY基因。用本文所述的簡(jiǎn)并探針及來自絲狀真菌的基因組DNA或第一條鏈cDNA的PCR也可以得到CPY特異性產(chǎn)物，然后可以用其作為探針克隆相應(yīng)的基因組或cDNA。本發(fā)明基因在產(chǎn)生絲狀子囊菌，例如曲霉的羧肽酶-缺陷型突變體時(shí)特別有用?？梢杂煤芏喾椒ㄟ_(dá)到該目的。在一種方法中，如下文進(jìn)一步描述的，將一個(gè)選擇性標(biāo)記克隆到CPY基因個(gè)中部。用限制酶將破壞的片段從母本質(zhì)粒中釋放出。用所述線性化的DNA片段轉(zhuǎn)化所選的宿主細(xì)胞。在所述的宿主細(xì)胞中，同源末端與宿主染色體配對(duì)，同源重組產(chǎn)生了染色體基因替代。與真菌細(xì)胞宿主可一起使用的可選擇標(biāo)記包括amdS，pyrG；argB，niaD，sC，和hygB。另外，用兩種可選擇標(biāo)記可以使用兩步法。在所述的一種方法中，用在CPY配對(duì)內(nèi)切割一次以便在轉(zhuǎn)化過程中靶整合到CPY座位的限制酶消化含有截?cái)嗟腃PY基因和可選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒。然后在選擇丟失可選擇標(biāo)記的培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化體生長(zhǎng)，例如若標(biāo)記為pyrG時(shí)，培養(yǎng)基可含有5-fluorooticacid。在野生型CPY和導(dǎo)入的截?cái)嗟腃PY基因之間重組時(shí)，常常發(fā)生可選擇標(biāo)記的丟失。與約50％的所得菌株應(yīng)只有截?cái)嗟腃PY基因，而另外50％只含有野生型基因。在Rothstein，Meth.Enzymol.194，281-301，1991中描述了所述方法。所產(chǎn)生的CPY缺陷型突變體在表達(dá)異源蛋白質(zhì)時(shí)，是特別有用的。在本發(fā)明中，“異源蛋白質(zhì)”指在所述宿主中天然不存在的蛋白質(zhì)，對(duì)天然序列已經(jīng)進(jìn)行了修飾的天然蛋白質(zhì)，或用重組DNA技術(shù)修飾宿主后，其表達(dá)在數(shù)量上發(fā)生了變化的天然蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括其突變體的表達(dá)使用了宿主中天然沒有的遺傳成分或使用了經(jīng)加工后，以在宿主中不常見的方式發(fā)揮作用的天然成分的天然蛋白質(zhì)。正如已經(jīng)提到的，由所選擇的宿主細(xì)胞而進(jìn)行的蛋白酶生產(chǎn)可以在其被回收前通過降解產(chǎn)物而嚴(yán)格限制了所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。因此由宿主生產(chǎn)的CPY的消除或量的減少實(shí)質(zhì)上提高了所需蛋白質(zhì)的產(chǎn)率，而且可以提供商業(yè)上可行的用于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的商業(yè)上通常不使用的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，CPY缺陷型細(xì)胞生產(chǎn)至少25％，優(yōu)選至少50％弱，且最佳為至少70％弱的CPY，與相應(yīng)的野生型相比，最多可喪失全部的CPY功能?？梢杂帽景l(fā)明的突變體真菌細(xì)胞以與野生型菌株相同的方法用于重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員很容易從本文所述的具體實(shí)施方案中認(rèn)識(shí)各種途徑的變化，所述實(shí)施方案根據(jù)上述菌株而對(duì)方法加以改進(jìn)。用表達(dá)載體可以表達(dá)活性形式的所需基因。有用的表達(dá)載體含有可以使所述載體穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞的基因組中或使載體在宿主細(xì)胞基因組外獨(dú)立自主復(fù)制的元件，以及優(yōu)選的一種或多種可以很容易地篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型標(biāo)記。所述表達(dá)載體還可以包括編碼啟動(dòng)子的序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始密碼子和，可選擇的阻遏物基因或激活物基因。為了在控制序列的指導(dǎo)下表達(dá)，根據(jù)本發(fā)明所用的基因優(yōu)選的在適當(dāng)?shù)拈喿x框中與所述的控制序列可操作相連。表達(dá)載體可以是任何可方便地利用重組DNA技術(shù)的載體，而且載體的選擇通常取決于其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是曲霉屬的菌株。因此載體可以是自主復(fù)制載體，即可以作為染色體外個(gè)體而存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒或一種染色體外元件，小染色體，或人工染色體。另外，所述載體可以是當(dāng)其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，可整合到宿主細(xì)胞染色體并與其所整合上的染色體一起復(fù)制的載體。在所述載體中，所需基因的序列應(yīng)與適宜的啟動(dòng)子序列可操作相連。所述啟動(dòng)子可以是在所選的宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并且可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的基因。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的例子是得自編碼米曲霉TAKA淀粉酶，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉或泡盛葡糖淀粉酶(glaA)，Rhizomucormiehei脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選的是TAKA-淀粉酶和glaA啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)載體還可以含有適宜的轉(zhuǎn)錄終止子，和在真核細(xì)胞中與編碼異源基因序列的DNA序列可操作相連的多聚腺苷酸序列。終止和多聚腺苷酸序列適宜的可從與啟動(dòng)子相同的來源得到。所述載體還可以含有能夠使載體在所研究的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的實(shí)例是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。所述載體還可以含有選擇性標(biāo)記，例如其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞中的缺陷的基因，或賦予抗生素抗性，例如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性的基因。曲霉選擇標(biāo)記的實(shí)例包括amdS，PYrGmargB，niaDsC，和hygB，產(chǎn)生hygromycin抗性的標(biāo)記。在曲霉宿主細(xì)胞中優(yōu)選使用構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG。此外，例如按WO91/17243中的描述通過共轉(zhuǎn)化來完成選擇。通常優(yōu)選的是表達(dá)后得到細(xì)胞外產(chǎn)物。因此所述蛋白質(zhì)含有可以將表達(dá)的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中的前區(qū)。如果需要，所述前區(qū)可以是本發(fā)明蛋白質(zhì)的天然的，或經(jīng)編碼相應(yīng)前區(qū)的DNA序列一般取代而用不同前區(qū)或信號(hào)序列取代的。例如，所述前區(qū)可以得自曲霉種的葡糖淀粉酶或淀粉酶基因，桿菌種的淀粉酶基因，Rhizomucormiehei的脂酶或蛋白酶基因，啤酒酵母α-因子的基因或牛前原凝乳酶基因。當(dāng)宿主是真菌細(xì)胞時(shí)，特別優(yōu)選的是米曲霉TAKA淀粉酶，黑曲霉中性淀粉酶，桿菌NCIB11837的maltogenic淀粉酶，嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶或地衣形芽孢桿菌蛋白酶的前區(qū)。一種有效的信號(hào)序列是米曲霉TAKA淀粉酶信號(hào)，Rhizomucormiehei天冬氨酸蛋白酶信號(hào)和Rhizomucormiehei脂酶信號(hào)。分別用于連接本發(fā)明的DNA構(gòu)建體，啟動(dòng)子，終止子和其他成分然后將其插入含有復(fù)制所需的信息的適宜的載體中的方法，是本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員熟知的(參見例如，Sambrooketal.，MolecularCloning，1989)。可以用CPY缺陷型突變體表達(dá)任何所需的原核或真核蛋白質(zhì)，而且優(yōu)選用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)。這些細(xì)胞特別有用的是適用于表達(dá)過氧化氫酶，漆酶，酚氧化酶，氧化酶，氧化還原酶，纖維素酶，木聚糖酶，過氧化物酶，脂酶，水解酶，酯酶，角質(zhì)酶(cutinase)蛋白酶和其他蛋白水解酶，氨肽酶，羧肽酶，植酸酶，裂解酶，果膠酶和其他果膠水解(pectinolytic)酶，淀粉酶，葡糖淀粉酶，半乳糖苷酶，半乳糖苷酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，甘露糖苷酶，異構(gòu)酶，蔗糖酶，轉(zhuǎn)移酶，核糖核酸酶，幾丁質(zhì)酶和脫氧核糖核酸酶。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員應(yīng)該理解，術(shù)語“真菌酶”不僅包括天然真菌，而且包括經(jīng)氨基酸取代，缺失，加入或?yàn)樘岣咂浠钚?，熱穩(wěn)定性，pH耐受性等而修飾過的真菌酶。也可以用所述突變體表達(dá)藥物學(xué)上的異源蛋白質(zhì)，例如激素，生長(zhǎng)因子，受體等。將用下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I.分離黑曲霉CPY基因A.材料和方法i.菌株在下文描述的方法中使用了下列生物材料。E.coliK802(ek4-(nrca)，mcrB，hsdR2，galD2，GalT22，WupE44，metB1；E.coliSOLP(E14-(mcrA)(mcrCB-hsdSMR-mrr)171，sbcC，recB，recJ，uvrC，umuDTn5(kanr)，lacgryS96，relA1，thi-1，endA1，λR[F’proABlacIqZΔM15]Su-，E.coliJM101supE，thi-1，Δ(lac-proAB)，[F’traD36，proAB，lacIqZΔM15]，E.coliXL-1BluerecA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17，supE44，relA1，lac[F’proABlacIqZΔM15，Tn10(tetR)]，黑曲霉Bo-1，黑曲霉SFAG-2。ii.PCR擴(kuò)增用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在45℃退火來進(jìn)行PCR。用黑曲霉Bo-1基因組DNA作為模板，用下列簡(jiǎn)并寡核苷酸。引物1-1(94-282)-GGIGGICCIGGITGYTC引物1-2(94-283)-GGIGGICCIGGITGYAG引物2-1(94-284)-CCIAGCCARTTRCADAT引物2-2(94-285)-CCYAACCARTTRCADAT引物3-1(94-331)-GTIGGITTYTCITAYTCIGG引物3-2(94-332)-GTIGGITTYAGYTAYAGYGG引物4-1(94-329)-GARTCITAYGCIGGICAYTA引物2-1(94-284)-GARAGYTAYGCIGGICAYTA在上述引物中I代表肌苷，Y代表C或T，R代表A或G，D代表A，G或T。iii.亞克隆PCR產(chǎn)物按制造商的說明，用TACloning試劑盒(Invitrogen)將PCR產(chǎn)物亞克隆以進(jìn)行測(cè)序。iv.從λZapII體內(nèi)切割通過在大腸桿菌SOLR中傳代，然后按照Strategene提供的方法，可從CPYcDNAλZap克隆獲得含有在pBluescriptSK載體中攜帶了cDNA插入子的質(zhì)粒。v.DNA測(cè)序用熒光標(biāo)記的核苷酸，利用聚合酶循環(huán)測(cè)序確定核苷酸測(cè)序。在AppliedBiosystems自動(dòng)DNA測(cè)序儀(Model363A，1.20版)上電泳測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物。使用下列CPY特異性引物，再使用M13反向(-48)和M13(-20)前向引物(Sangeretal.，J.Mol.Biol.143163-178)94-376TCGCTGCCAGTCTATGATTGA94-377ACATCAACCGCAACTTCCTCT94-378TTGCCAATGAGAACGGACTGC94-379CGCACTTACCACGGACATCAT94-503CAAGCATCCTCAAACTATCGT94-504GAGACGCATGAAGGTGAAGTT94-505GCCGTCCCTCCCTTCCAGCAG94-506GTGCCGACGGGTTCTCCAAGC94-507GCAGCGAGGAAGAGCGTTGTC94-510GGGTCATTCTCGGGGTCATTG94-511GACCCCGAGAATGACCCTGTT94-512GTAGGGCTTCATCCAGTCACC94-513TCTCACCGTTCTCACCAGTAA94-514TCCCTCCCCAAGAAGCACAAC94-528AGCGTCTGGGTTACTGGTGAG94-529AAGATCGGCCAGGTCAAGTCC94-530GAGACGGTGGTAGGGCTTCAT94-531AACGTCGGTTACTCTTACAGC94-532GTGGTCGGGGCGGCGGTTGTG94-533TGTTTGAAGAAGAGGGTAAGC94-575CGCTGCTACTTGATTTTTCTA94-576CTCAGCGCCAACAGCCTCAAT94-577ACCTGCAGTCCGTTCTTATTG94-634TGCGATCGATTCATTCTCATC94-635GGAGTAACCGACATTGACAGG94-536CCTGTCAATGTCGGTTACTCC94-637GTCCCATGGCAACTTCACCTT94-646CTTCTCACCGTTCTCACCAGT94-647CGAGACTCGAAGAACCCTAAGB.結(jié)果用黑曲霉Bo-1基因組DNA為模板，，使用各種組合的CPY特異性簡(jiǎn)并寡核苷酸，引物1-1，1-2，2-1和2-2(圖1)完成PCR反應(yīng)。所有的反應(yīng)均以一個(gè)循環(huán)為95℃5分鐘，45℃1分鐘和72℃2分鐘，接著進(jìn)行25個(gè)下一循環(huán)，即95℃1分鐘，45℃1分鐘和72℃2分鐘。在瓊脂糖凝膠上將反應(yīng)物小樣(10μl)電泳，在兩個(gè)反應(yīng)中，一個(gè)使用引物1-2和2-1，另一個(gè)使用引物1-2和2-2，約1100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物占大部分。使用假設(shè)在那兒的這些寡核苷酸組合而預(yù)期的產(chǎn)物的大小在900bp的基因內(nèi)沒有內(nèi)含子，使用前向和反向引物將1100bp的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆并測(cè)序。7個(gè)亞克隆被測(cè)序，但是，沒有一個(gè)與CPY密碼子同源。使用與上述相同的條件，完成使用各種引物組合3-1，3-2，4-1，4-2，2-1和2-2的PCR。在瓊脂糖凝膠上電泳小樣，在兩個(gè)反應(yīng)中，一個(gè)使用引物4-1和2-1，另一個(gè)使用引物4-2和2-1，約600bp的擴(kuò)增產(chǎn)物占大部分。根據(jù)與其它羧肽酶的同源性而預(yù)測(cè)的該擴(kuò)增產(chǎn)物的大少為600bp。將600bp的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆，用前向和反向引物確定11個(gè)亞克隆的DNA序列。11個(gè)克隆中的9個(gè)以與啤酒酵母有69％的一致性為基礎(chǔ)，為黑曲霉CPY的密碼子。。所有9個(gè)均彼此相同，說明在黑曲霉中只有一個(gè)羧肽酶基因。將含有600bp黑曲霉CPYPCR產(chǎn)物的亞克隆稱為pDSY17。用pDSY17的插入子探測(cè)黑曲霉Bo-1基因組DNA的Southerm印跡。用Gibco-BRL的缺口-翻譯試劑盒放射性標(biāo)記探針。所用的雜交條件為于60℃，在1.5×SSPE，1％SDS和0.5％脫脂牛奶和200μg/ml鮭精DNA。于65℃用0.2×SSC，1％SDS和0.1％焦磷酸鈉將印跡洗滌兩次，每次15分鐘。在BamHI，HindIII和SalI的消化產(chǎn)物中，約10，5.5和7kb的單帶分別與CPY探針雜交。為了分離CPY的全長(zhǎng)基因，用PCR-產(chǎn)生的CPY基因片段(用Gibco-BRL的缺口-翻譯試劑盒標(biāo)記的)，探測(cè)含有約26，000個(gè)重組體的黑曲霉Bo-1的EMBL4中的基因組庫。將約28,000個(gè)噬菌斑放在濾器上并檢測(cè)。從這些平皿中撿出11個(gè)陽性的。純化后，9個(gè)一級(jí)克隆仍與CPY探針雜交。從9個(gè)克隆中分離DNA，進(jìn)行限制酶消化以對(duì)其進(jìn)行表征。從限制圖譜看，9個(gè)中有7個(gè)是相同的。其他兩個(gè)克隆是特有的。從克隆的Southern產(chǎn)物，確定9個(gè)中的8個(gè)含有與CPY探針雜交的約5.5kb的相同HindIII片段。不含有相同HindIII片段的克隆含有較大(＞12kb)的與CPY探針雜交的HindIII片段。亞克隆共有的HindIII片段以進(jìn)行DNA測(cè)序?；蚪MDNA序列和推測(cè)的氨基酸序列示于圖1。再篩選黑曲霉SFAG-2的λZAPII(Stratagene)中的cDNA庫。將42,000個(gè)噬菌斑放到濾器上，然后用上述的CPY探針檢測(cè)，在嚴(yán)格的上述條件下，112個(gè)這樣的噬菌斑進(jìn)行了雜交。撿出開始的20個(gè)，然后進(jìn)行再篩選，純化后，18個(gè)仍與CPY探針雜交。從4個(gè)陽性克隆中，用配有λZAP試劑盒的體內(nèi)切割方法分離DNA。用EcoRI消化獲救的質(zhì)粒，然后在瓊脂糖凝膠上電泳以確定插入片段的大小。兩個(gè)克隆(2-1和3-2)似乎有足夠大的插入片段，可含有全長(zhǎng)CPY的cDNA，而且各含有約1700和250bp的兩個(gè)EcoRI片段。預(yù)計(jì)的全長(zhǎng)cDNA的大小約為1600bp。另兩個(gè)cDNA克隆(2-2和2-4)含有較小的插入片段，但是，它們均含有250bp的EcoRI片段。確定了克隆3-2和2-2的部分DNA序列，3-2含有全長(zhǎng)cDNA，而克隆2-2在5’末端被截?cái)嗉s200bp。確定了兩個(gè)鏈的完整cDNA序列(圖2)。認(rèn)為cDNA編碼557個(gè)氨基酸長(zhǎng)的CPY前體。到目前為止，cDNA和基因組克隆之間的大多數(shù)核苷酸差異均處于擺動(dòng)范圍內(nèi)，這點(diǎn)不令人驚奇，因?yàn)樗鼈兪莵碜詢蓚€(gè)不同的黑曲霉菌株。以啤酒酵母的CPY排列為基礎(chǔ)，黑曲霉CPY看起來含有信號(hào)肽和前肽，成熟CPY蛋白質(zhì)為419或420個(gè)氨基酸長(zhǎng)。黑曲霉CPY與啤酒酵母和C.albicans的CPY(Mukhtaretal.，Gene121173-177，1992)分別有約65％和66％的一致性。II制備CPY缺陷型突變體為了產(chǎn)生缺失了CPY的黑曲霉菌株，制備其中米曲霉pyrG基因插入到CPY編碼區(qū)中的構(gòu)建體(圖3)。將含有幾乎完整CPY基因和約6kb基因下游的約6.5kbHindIII片段亞克隆到pKS+(Stratagene)衍生物中，其中破壞了PstI位點(diǎn)。用PstI消化所得的重組體，以便從CPY編碼區(qū)缺失815bp的片段，加入T4DNA聚合酶和所有4種dNTP而補(bǔ)平因PstI消化而產(chǎn)生的懸末端。將所得的平整末端載體與通過用HindIII消化，然后用Klenow片段填平而得到的約3.8kb平整末端的片段相連。用HindIII消化其中含有pyrG插入片段的最終構(gòu)建體，以得到用于轉(zhuǎn)化黑曲霉pyrG菌株的線性片段，在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)進(jìn)行篩選。用Southern印跡篩選轉(zhuǎn)化體以確定那些菌株含有破壞的CPY基因。用Western印跡分析轉(zhuǎn)化體以尋找在細(xì)胞內(nèi)丟失的CPY。一旦鑒定了一個(gè)菌株含有破壞了的CPY，就可以確定對(duì)異源蛋白質(zhì)的影響。生物材料的保藏已于1994年9月13日將下列生物材料保藏在AgriculturalResearchServiceCultureCollection(NRRL)1815NorthUniversityStreet，Peoria，Illinois61604。細(xì)胞系保藏號(hào)含有pDSY23的NRRLB-21326E.coli(EMCC#0120)序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)名稱NovoNordiskBiotech，Inc.(B)街道1445DrewAvenue(C)城市Davis(D)州California(E)國(guó)家US(F)郵編95616-4880(G)電話(916)757-8100(H)電傳(916)758-0317(ii)發(fā)明題目編碼黑曲霉羧肽酶的基因(iii)序列數(shù)目4(iv)相關(guān)地址(A)收件人NovoNordiskofNorthAmerica，Inc.(B)街道405LexingtonAvenue，Suite6400(C)城市NewYork(D)州NewYork(E)國(guó)家U.S.A.(F)郵編10174-6401(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.25(EPO)(vi)目前的申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(B)申請(qǐng)日19-9月-1995(C)分類號(hào)(vii)在先申請(qǐng)資料(A)申請(qǐng)?zhí)朥S08/309,341(B)申請(qǐng)日20-9月-1994(viii)代理人/代理資料(A)姓名Lowney，KarenA.(B)登記號(hào)31，274(C)文件號(hào)4247.204-WO(ix)通訊資料(A)電話2128670123(B)電傳2128670298(2)SEQIDNO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2068個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(vi)來源(A)生物黑曲霉(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞內(nèi)含子(B)位置572...632(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置連接(571..633)(xi)序列描述SEQIDNO1TCCTCTGCCTACTCATCCCATCACCATCTCAATTCATACCGCCCCCGTGGGGTTTCAGCA60CCAATGAGAGTCCTTCCAGCTGCTATGCTGGTTGGAGCGGCCACGGCG108MetArgValLeuProAlaAlaMetLeuValGlyAlaAlaThrAla151015GCCGTTCCTCCCTTCCAGCAGGTCCTTGGAGGTAACGGTGCCAAGCAC156AlaValProProPheGlnGlnValLeuGlyGlyAsnGlyAlaLysHis202530GGTGCCGACCATGCGGCCGAGGTCCCTGCGGATCACAGTGCCGACGGG204GlyAlaAspHisAlaAlaGluValProAlaAspHisSerAlaAspGly354045TTCTCCAAGCCGCTGCACGCATTCCAGGAGGAGCTGAAGTCTCTCTCT252PheSerLysProLeuHisAlaPheGlnGluGluLeuLysSerLeuSer505560GACGAGGCTCGTAAGCTTTGGGATGAGGTGGCCAGCTTCTTCCCGGAG300AspGluAlaArgLysLeuTrpAspGluValAlaSerPhePheProGlu657075AGCATGGATCAGAACCCTCTCTTTTCCCTCCCCAAGAAGCACAACCGC348SerMetAspGlnAsnProLeuPheSerLeuProLysLysHisAsnArg80859095CGTCCCGACTCGCACTGGGACCACATCGTCCGCGGCTCCGACGTTCAG396ArgProAspSerHisTrpAspHisIleValArgGlySerAspValGln100105110AGCGTCTGGGTCACTGGTGAGAACGGTGAGAAGGAGCGCGAGGTCGAT444SerValTrpValThrGlyGluAsnGlyGluLysGluArgGluValAsp115120125GGCAAGCTGGAAGCCTATGATCTCAGGGTCAAGAAGACCGATCCTGGC492GlyLysLeuGluAlaTyrAspLeuArgValLysLysThrAspProGly130135140TCTCTTGGCATCGACCCCGGCGTGAAGCAGTACACCGGTTATCTCGAT540SerLeuGlyIleAspProGlyValLysGlnTyrThrGlyTyrLeuAsp145150155GACAACGAGAATGATAAGCATTTGTTCTACGTAAGCACACCTTGGTTCAA590AspAsnGluAsnAspLysHisLeuPheTyr160165GATCACGCTTTTTATATGCTCTGGATATCTAACGCAACTTAGTGGTTCTTCGAG644TrpPhePheGlu170TCTCGCAATGACCCCGAGAATGATCCCGTTGTTCTGTGGCTGAACGGT692SerArgAsnAspProGluAsnAspProValValLeuTrpLeuAsnGly175180185GGCCCTGGGTGCTCTTCCCTCACCGGTCTCTTCATGGAGCTTGGCCCT740GlyProGlyCysSerSerLeuThrGlyLeuPheMetGluLeuGlyPro190195200205AGCAGCATCAACAAGAAGATCCAGCCGGTCTACAATGACTACGCTTGG788SerSerIleAsnLysLysIleGlnProValTyrAsnAspTyrAlaTrp210215220AACTCCAACGCGTCCGTGATCTTCCTTGACCAGCCTGTCAATGTCGGT836AsnSerAsnAlaSerValIlePheLeuAspGlnProValAsnValGly225230235TACTCCTACAGTAACTCTGCTGTCAGCGACACGGTCGCTGCTGGCAAG884TyrSerTyrSerAsnSerAlaValSerAspThrValAlaAlaGlyLys240245250GACGTCTATGCCTTGCTTACCCTCTTCTTCAAACAATTCCCCGAGTAT932AspValTyrAlaLeuLeuThrLeuPhePheLysGlnPheProGluTyr255260265GCTAAGCAGGACTTCCACATTGCCGGTGAATCTTATGCTGGTCACTAT980AlaLysGlnAspPheHisIleAlaGlyGluSerTyrAlaGlyHisTyr270275280285ATCCCCGTCTTCGCTTCGGAGATCCTGTCTCACAAGAAGCGCAACATC1028IleProValPheAlaSerGluIleLeuSerHisLysLysArgAsnIle290295300AACCTGCAGTCCGTTCTCATTGGCAACGGTCTCACCGACGGATACACC1076AsnLeuGlnSerValLeuIleGlyAsnGlyLeuThrAspGlyTyrThr305310315CAGTACGAGTACTACCGTCCCATGGCCTGCGGTGACGGCGGTTACCCA1124GlnTyrGluTyrTyrArgProMetAlaCysGlyAspGlyGlyTyrPro320325330GCTGTCTTGGACGAGAGCTCCTGCCAGTCCATGGACAACGCTCTTCCT1172AlaValLeuAspGluSerSerCysGlnSerMetAspAsnAlaLeuPro335340345CGCTGCCAGTCTATGATTGAGTCTTGCTACAGTTCCGAGAGCGCTTGG1220ArgCysGlnSerMetIleGluSerCysTyrSerSerGluSerAlaTrp350355360365GTTTGTGTCCCGGCCTCCATCTACTGTAACAACGCCCTCCTTGCCCCT1268ValCysValProAlaSerIleTyrCysAsnAsnAlaLeuLeuAlaPro370375380TACCAGCGCACTGGGCAGAACGTCTATGATGTCCGTGGTAAGTGCGAG1316TyrGlnArgThrGlyGlnAsnValTyrAspValArgGlyLysCysGlu385390395GATAGCTCTAACCTTTGCTACTCGGCTATGGGCTACGTCAGCGACTAC1364AspSerSerAsnLeuCysTyrSerAlaMetGlyTyrValSerAspTyr400405410CTGAACAAGCCCGAAGTCATCGAGGCTGTTGGCGCTGAGGTCAACGGC1412LeuAsnLysProGluValIleGluAlaValGlyAlaGluValAsnGly415420425TACGACTCGTGCAACTTTGACATCAACCGCAACTTCCTCTTCCACGGT1460TyrAspSerCysAsnPheAspIleAsnArgAsnPheLeuPheHisGly430435440445GACTGGATGAAGCCCTACCACCGCCTCGTTCCGGGACTCCTGGAGCAG1508AspTrpMetLysProTyrHisArgLeuValProGlyLeuLeuGluGln450455460ATCCCTGTCTTGATCTATGCCGGTGATGCTGATTTCATTTGCAACTGG1556IleProValLeuIleTyrAlaGlyAspAlaAspPheIleCysAsnTrp465470475CTGGGCAACAAGGCCTGGACTGAAGCCCTGGAGTGGCCCGGACAGGCT1604LeuGlyAsnLysAlaTrpThrGluAlaLeuGluTrpProGlyGlnAla480485490GAATATGCCTCCGCTGAGCTGGAGGATCTGGTCATTGTCGACAATGAG1652GluTyrAlaSerAlaGluLeuGluAspLeuValIleValAspAsnGlu495500505CACACGGGCAAGAAGATTGGCCAGGTTAAGTCCCATGGCAACTTCACC1700HisThrGlyLysLysIleGlyGlnValLysSerHisGlyAsnPheThr510515520525TTCATGCGTCTCTATGGTGGTGGCCACATGGTCCCGATGGACCAGCCC1748PheMetArgLeuTyrGlyGlyGlyHisMetValProMetAspGlnPro530535540GAGTCGAGTCTCGAGTTCTTCAACCGCTGGTTGGGAGGTGAATGGTTC1796GluSerSerLeuGluPhePheAsnArgTrpLeuGlyGlyGluTrpPhe545550555TAAAGACGTGCTACCACCGCATATAGACTTTCTGGTCATTTCGGTGACACTGC1849AGATATGTTTCTTAACGATAGTTTGAGCATGCTTGTCAATGCCCACTAGTCCCGATCCTT1909ATATGTTGCATGGTATCTATGAGTTTTGTCACTATAGTGCATTATACATGTGTACTTCGT1969ATGAGAATGAATCGATCGCATTTACACGCATATAAATAGTACCCACCTCCGCCTGGACAT2029GAATTAGGCCCGGCCAGTCGTTTACATACAGTGCTAGAA2068(2)SEQIDNO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度557個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物黑曲霉(xi)序列描述SEQIDNO2MetArgValLeuProAlaAlaMetLeuValGlyAlaAlaThrAlaAla151015ValProProPheGlnGlnValLeuGlyGlyAsnGlyAlaLysHisGly202530AlaAspHisAlaAlaGluValProAlaAspHisSerAlaAspGlyPhe354045SerLysProLeuHisAlaPheGlnGluGluLeuLysSerLeuSerAsp505560GluAlaArgLysLeuTrpAspGluValAlaSerPhePheProGluSer65707580MetAspGlnAsnProLeuPheSerLeuProLysLysHisAsnArgArg859095ProAspSerHisTrpAspHisIleValArgGlySerAspValGlnSer100105110ValTrpValThrGlyGluAsnGlyGluLysGluArgGluValAspGly115120125LysLeuGluAlaTyrAspLeuArgValLysLysThrAspProGlySer130135140LeuGlyIleAspProGlyValLysGlnTyrThrGlyTyrLeuAspAsp145150155160AsnGluAsnAspLysHisLeuPheTyrTrpPhePheGluSerArgAsn165170175AspProGluAsnAspProValValLeuTrpLeuAsnGlyGlyProGly180185190CysSerSerLeuThrGlyLeuPheMetGluLeuGlyProSerSerIle195200205AsnLysLysIleGlnProValTyrAsnAspTy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