用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應(yīng)用的制作方法

用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應(yīng)用的制作方法用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的lamp引物及應(yīng)用的制作方法本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的引物為引物組，由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發(fā)明利用以上引物，通過(guò)在反應(yīng)液加入SYBR?Green?I熒光染料，建立了IHNV?RT-LAMP可視化檢測(cè)方法，且該方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，這對(duì)鮭鱒魚(yú)魚(yú)苗的引種、無(wú)特定病原體種魚(yú)的培育，以及鮭鱒魚(yú)無(wú)公害健康養(yǎng)殖均有重要意義。【專(zhuān)利說(shuō)明】用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的LAMP引物及應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]傳染性造血器官壞死病(infectioushaematopoieticnecrosis,IHN)是由傳染性造血器官壞死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)引起的一種常見(jiàn)的危害鮭鱒魚(yú)類(lèi)的急性病毒性傳染病。自從上世紀(jì)50年代在美國(guó)首次暴發(fā)以來(lái)，IHNV已經(jīng)擴(kuò)散至歐洲、澳洲、亞洲等十余個(gè)國(guó)家。IHNV可造成鮭鱒魚(yú)魚(yú)苗近100%的死亡率，對(duì)世界的鮭鱒魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，實(shí)用、快速、靈敏、準(zhǔn)確的IHNV檢測(cè)技術(shù)的建立在IHN早期診斷、水產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督、疫情監(jiān)測(cè)等方面具有重要的意義。目前，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的IHN的幾種診斷方法包括細(xì)胞培養(yǎng)分離方法、免疫學(xué)方法(中和試驗(yàn)法、間接熒光抗體法和ELISA法)和分子生物學(xué)方法(PCR法、PCR探針和序列測(cè)定法)。PCR方法是目前最常用的快速檢測(cè)方法，已經(jīng)有以PCR技術(shù)為依托的商業(yè)化的IHNV檢測(cè)試劑盒，這些檢測(cè)試劑盒需要專(zhuān)門(mén)的儀器或者對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳與紫外線(xiàn)分析才能確定檢測(cè)結(jié)果。[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)是2000年Notomi等在PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)建的另外一種形式的核酸擴(kuò)增技術(shù)。與PCR技術(shù)相比，兩者最大的差異在于靶基因引物的設(shè)計(jì)上。其中，PCR只使用一對(duì)與靶基因兩端序列互補(bǔ)的上下游引物，而LAMP則針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域，設(shè)計(jì)4種特異引物一內(nèi)側(cè)引物對(duì)和外側(cè)引物對(duì)，必要時(shí)再加上環(huán)形引物對(duì)，對(duì)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，因此其特異性和敏感性均比PCR更高?！景l(fā)明內(nèi)容】[0004]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。[0005]本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，具體可為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；[0006]所述引物I(F3)、所述引物2(B3)、所述引物3(FIP)、所述引物4(BIP)、所述引物5(Loop-F)和所述引物6(Loop-B)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。[0007]所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比可為1:1:8:8:4:4。所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比可為1:1:8:8。[0008]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述引物I(F3)和所述引物2(B3)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為0.2PM;所述引物3(FIP)和所述引物4(BIP)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為1·6μΜ;所述引物5(Loop-F)和所述引物6(Loop-B)在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度均為O.8μΜ。[0009]所述引物組中，引物I(F3)和引物2(Β3)組成外側(cè)引物對(duì)；引物3(FIP)和引物4(BIP)組成內(nèi)側(cè)引物對(duì)；引物5(Loop-F)和引物6(Loop-B)組成環(huán)形引物對(duì)。序列I由20個(gè)核苷酸組成，序列2由20個(gè)核苷酸組成，序列3由45個(gè)核苷酸組成，序列4由46個(gè)核苷酸組成，序列5由18個(gè)核苷酸組成，序列6由20個(gè)核苷酸組成。[0010]本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。[0011]本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，具體可包括反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和所述引物組。[0012]當(dāng)所述引物組為所述引物組A時(shí)，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比可為5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：20pmol：20pmol：25mmol：5nmol：IOU：8U0[0013]當(dāng)所述引物組為所述引物組B時(shí)，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比可為5pmol：5pmol：40pmol：40pmol：25mmol：5nmoI：IOU:8U。[0014]在本發(fā)明中，所述反轉(zhuǎn)錄酶具體可為AMV反轉(zhuǎn)錄酶；所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst2.ODNA聚合酶(如NEB公司產(chǎn)品目錄號(hào)為M0537S的產(chǎn)品）或BstDNA聚合酶或BstDNA聚合酶大片段。[0015]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑具體由所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶、所述Bst2.ODNA聚合酶、所述dNTPs、10X等溫?cái)U(kuò)增緩沖液和所述引物組組成；其中，所述IOX等溫?cái)U(kuò)增緩沖液的ρΗ8·8，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下：Tris-HC120mM、KC150mM、（NH4)2SO4IOmM、MgS042mM、Tween-20體積分?jǐn)?shù)O.1%。[0016]所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；所述Bst2.ODNA聚合酶為NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品。[0017]在實(shí)際使用過(guò)程中，上述試劑的各組分在(逆轉(zhuǎn)錄）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中的終濃度為：所述引物I和所述引物2各0.2μmol/L;所述引物3和所述引物4各1.6μmol/L;所述引物5和所述引物6各O.8ymol/L;所述dNTPslmmol/μL;所述AMV反轉(zhuǎn)錄酶O.4U/μL;所述Bst2.ODNA聚合酶O.32U/μL;所述IOX等溫?cái)U(kuò)增緩沖液體積分?jǐn)?shù)10%。[0018]本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。[0019]本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，含有所述擴(kuò)增試劑和熒光顯色劑。[0020]所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGreenI(如Invitrogen公司產(chǎn)品）。[0021]如下a)或b)的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：[0022]a)所述引物組在制備所述試劑盒中的應(yīng)用；[0023]b)所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。[0024]應(yīng)用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒的方法，包括如下步驟:用所述引物組，或所述試劑，或所述試劑盒在63-65°C(如63°C或65°C)條件下對(duì)所述待測(cè)樣品進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)60min的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，之后在80°C放置2min終止反應(yīng)，按照如下方法確定所述待測(cè)樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒:向反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI型核酸染料，如果反應(yīng)液變成熒光綠色，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若反應(yīng)體系呈現(xiàn)紅棕色，則說(shuō)明待測(cè)樣品中沒(méi)有傳染性造血器官壞死病毒，該方法實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化。當(dāng)然也可將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)待測(cè)樣品中是否含有傳染性造血器官壞死病毒，電泳檢測(cè)若出現(xiàn)階梯狀DNA條帶，則說(shuō)明待測(cè)樣品中含有傳染性造血器官壞死病毒，若未出現(xiàn)階梯狀DNA條帶，則說(shuō)明待測(cè)樣品中沒(méi)有傳染性造血器官壞死病毒。[0025]所述待測(cè)樣品來(lái)源于淡水或海洋動(dòng)物，如魚(yú)類(lèi)，具體如鮭鱒魚(yú)。[0026]在本發(fā)明中，所述傳染性造血器官壞死病毒為感染魚(yú)類(lèi)(如鮭鱒魚(yú))的傳染性造血器官壞死病毒，具體如傳染性造血器官壞死病毒(IHNV)毒株WRAC(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC*Number:VR-1392TM)。[0027]本發(fā)明將逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP)引入到傳染性造血器官壞死病毒(infectioushaematopoieticnecrosisvirus,IHNV)檢測(cè)中，建立了簡(jiǎn)單、快速、靈敏的IHNV檢測(cè)方法。針對(duì)IHNV的聚合酶蛋白基因(Polymeraseprotein,L)的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異性引物，以IHNV基因組RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶和BstDNA聚合酶的作用下進(jìn)行RT-LAMP，反應(yīng)產(chǎn)物添加SYBRGreenI熒光染料后，通過(guò)肉眼觀(guān)察陽(yáng)性樣本表現(xiàn)為熒光綠色，而陰性樣本表現(xiàn)為紅棕色。該方法實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)結(jié)果的可視化。特異性分析顯示該方法不與傳染性胰腺壞死病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV)及同屬的水生動(dòng)物病毒性出血敗血癥(viralhaemorrhagicsepticaemiavirus,VHSV)發(fā)生交叉反應(yīng),并且可檢測(cè)不低于IOpfuIHNV的RNA，具有良好的特異性和很高的靈敏性。以上可視化結(jié)果均被2%瓊脂糖凝膠電泳證明。本研究所建立的IHNVRT-LAMP可視化檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好、成本低、不依賴(lài)任何專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)鮭鱒魚(yú)魚(yú)苗的引種、無(wú)特定病原體種魚(yú)的培育，以及鮭鱒魚(yú)無(wú)公害健康養(yǎng)殖均有重要意義?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0028]圖1為不同稀釋度病毒懸液感染EPC細(xì)胞后在細(xì)胞板上形成的空斑。[0029]圖2為RT-LAMP檢測(cè)方法反應(yīng)溫度優(yōu)化結(jié)果。其中，A為可視化檢測(cè)結(jié)果，1:陰性對(duì)照；2-4:61°C、63°C、65°C。B為凝膠檢測(cè)結(jié)果，泳1:陰性對(duì)照；2_4:61°C、63°C、65°C；M:DL2000DNAMarker。[0030]圖3為RT-LAMP檢測(cè)方法特異性檢測(cè)結(jié)果。其中，A為可視化檢測(cè)結(jié)果，I:IHNV；2:IPNV；3:VHSV；B為凝膠檢測(cè)結(jié)果，I:IHNV；2:IPNV；3:VHSV；M:DL2000DNAMarker。[0031]圖4為RT-LAMP檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果。其中，A為可視化檢測(cè)結(jié)果，1_7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNVRNA。B為凝膠檢測(cè)結(jié)果，1-7:5、10、25、50、102、103、104pfuIHNVRNA；M:DL2000DNAMarker。[0032]圖5為用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果結(jié)果。其中，A為可視化檢測(cè)結(jié)果，1-7:1-7號(hào)樣品；B為凝膠檢測(cè)結(jié)果，1-7:1-7號(hào)樣品，M：DL2000DNAMarker。【具體實(shí)施方式】[0033]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。[0034]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0035]傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)毒株WRAC:美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ΛI(xiàn)CX'"Number:VR_1392TM。[0036]傳染性膜腺壞死病毒（infectiouspancreaticnecrosisvirus,IPNV):美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCCkNumber：VR-890TM。[0037]水生動(dòng)物病毒性出血敗血癥（viralhaemorrhagicsepticaemiavirus,VHSV)：美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Λ?_α."Number:VR-1387ΤΜ。[0038]AMV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為M5101;Bst2.ODNA聚合酶購(gòu)自NEB公司，其產(chǎn)品目錄號(hào)為M0537S；SYBRGreenI和Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；DKZW-D-2電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)UniversalHoodII購(gòu)自BIO-RAD。[0039]實(shí)施例I、用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的制備及使用方法[0040]一、用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組的制備[0041]本實(shí)施例用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組由引物I、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成。這六個(gè)引物按照如下方法制備：根據(jù)GenBank收錄的IHNV聚合酶蛋白的多條基因序列，進(jìn)行比對(duì)，選取聚合酶基因特異性保守區(qū)段，利用在線(xiàn)軟件PrimerExplorerV4(https://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/)針對(duì)L基因保守區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)RT-LAMP引物，序列見(jiàn)表1，引物由哈爾濱博仕生物公司合成。[0042]表1L基因RT-LAMP弓丨物序列[0043]【權(quán)利要求】1.用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組，其特征在于:所述引物組A中所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩爾比為1:1:8:8:4:4;所述引物組B中所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩爾比為1:1:8:8。3.用于檢測(cè)傳染性造血器官壞死病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括反轉(zhuǎn)錄酶、鏈置換型DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和權(quán)利要求1或2所述的引物組。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于:所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述反轉(zhuǎn)錄酶和所述鏈置換型DNA聚合酶在所述擴(kuò)增試劑中的配比為5pmol:5pmol:40pmol:40pmol:20p