一種判定中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法

一種判定中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法專利名稱：一種判定中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種判定中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法。背景技術(shù)：白介素-12(IL-12)是一種異源二聚體細(xì)胞因子，主要在固有免疫應(yīng)答的過程中由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。一般認(rèn)為，IL-12是固有免疫對病原體的識別與產(chǎn)生適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要連接橋梁，是一種免疫調(diào)節(jié)因子。IL-12b，也稱p40，是IL-12的其中一個(gè)成分，能與p35(IL_12a)以共價(jià)鍵結(jié)合而形成成熟的IL-12蛋白。此外，IL-12b還能與pl9(IL_23a)相互作用形成IL-12家族的另一成員——IL-23。IL-23對T淋巴細(xì)胞的一個(gè)新的亞型——輔助性T淋巴細(xì)胞17(Thl7)具有很強(qiáng)的趨化作用。Thl7細(xì)胞能特征性產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17，后者與許多自身免疫性疾病的病理生理有明顯的相關(guān)。鑒于IL-12和IL-23在自身免疫性疾病的重要作用，其兩者的共同成分，IL-12b可能是自身免疫性疾病的一個(gè)重要的候選基因。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，IL-12b與銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及I型糖尿病等自身免疫性疾病相關(guān)。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種累及多器官的復(fù)雜自身免疫病，自身抗體的產(chǎn)生、免疫復(fù)合物的形成以及組織炎癥是其主要的臨床特征。文獻(xiàn)報(bào)道SLE的發(fā)病率為20-150人/10萬人，男女比例為1:9。SLE的病因尚未完全清楚，一般認(rèn)為基因與環(huán)境因素對其發(fā)病均有影響。近期，有系列的全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)探討SLE與基因多態(tài)性關(guān)系，使人們對這一復(fù)雜疾病有了更深入的了解。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的對SLE研究中存在的不足，提供一種方法，可以用于判定中國漢族人IL_12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的相關(guān)性。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種判定中國漢族人IL_12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法，該方法是非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法。更進(jìn)一步地，上述方法包括如下步驟(1)基因分型取外周血基因組DNA，采用非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法鑒定其基因型；(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率在病例組與正常組之間的差異來分析SNP是否與疾病相關(guān)，以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡定律結(jié)果來分析，用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度，P值小于O.05認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作為一種優(yōu)選方案，所述非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法是首先進(jìn)行不對稱PCR,20mL體系含基因組DNA模板20ng，fPCR緩存液，200mMdNTPs,0.5UrTaqDNA聚合酶，O.05mM正向引物，O.5mM反向引物和O.5mMC3封閉的探針。PCR反應(yīng)在Bio-RadS1000PCR儀上進(jìn)行；PCR擴(kuò)增條件如下94°C預(yù)變性2分鐘，繼之進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，包括94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，最后72°C延伸5min;反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移10mLPCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入ImLLCGreenPlus染料后，最后以HRMinCFX96實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)C1000ThermalCycler進(jìn)行檢測；樣本先95°C變性30s，再迅速冷卻到40°C30s，然后以O(shè).3°C/s速率從55°C升溫至90°C熔化，熔化曲線用Bio-RadPrecision分析軟件進(jìn)行分析；所述rs6887695引物序列為正向SEQIDN0:1，反向SEQIDN0:2;非標(biāo)記C3阻斷探針序列SEQIDNO:3。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果HRMA結(jié)合非標(biāo)記探針成功地區(qū)分所有的基因型。SLE患者的基因型和rs6887695等位基因頻率與健康對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs6887695次等位基因(C)對SLE具有保護(hù)作用(P=O.031,ORO.78,[95%ClO.63-0.98])對rs6887695基因的單核苷酸多態(tài)性與SLE診斷指標(biāo)相關(guān)性的研究發(fā)現(xiàn)，rs6887695次等位基因(C)對關(guān)節(jié)癥狀的發(fā)生率(P=O.013，OR=O.65，95%CI=O.47-0.92)以及抗核抗體異常(P=O.022，OR=O.68，95%CI=O.49-0.95)具有保護(hù)作用。IL_12b單核苷酸多態(tài)性與SLE其它診斷指標(biāo)無相關(guān)性。因此，在中國漢族SLE患者中，IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與SLE的發(fā)病危險(xiǎn)度相關(guān)，也與關(guān)節(jié)炎和自身抗體的產(chǎn)生相關(guān)。圖1為非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法分析樣本的基因型；圖中顯示探針區(qū)和非探針區(qū)rs6887695的熔融曲線圖。圖2為標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線和差異曲線顯示樣本的基因型；(A)標(biāo)準(zhǔn)化后的溶解曲線圖；(B)差異曲線圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1研究人群研究在北京大學(xué)深圳醫(yī)院共招募了297名符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)有關(guān)SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)的SLE患者(男27人，女270人，中位年齡29歲，年齡跨度為12-55歲，)和351名健康對照人群(男31人，女320人，中位年齡為28歲，年齡跨度為17-46歲)。所有對照組人員既無SLE家族史，也無任何SLE相關(guān)的癥狀。本研究獲得深圳醫(yī)院倫理委員會(huì)同意及所有參與者的知情同意?；蚍中筒捎肐nnogent的全基因組DNA提取試劑盒(Innogent,China),根據(jù)試劑盒說明書要求提取所收集的外周血基因組DNA。采用非標(biāo)記探針高分辨率溶解曲線法鑒定樣本的基因型。方法簡述如下首先進(jìn)行不對稱PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，TPCR緩存液(Takara,Japan),200mMdNTPs,O.5UrTaqDNA聚合酶(Takara,Japan),O.05mM正向引物，O.5mM反向引物和O.5mMC3封閉的探針。PCR反應(yīng)在Bio-RadS1000PCR儀上進(jìn)行(Bio-Rad,美國XPCR擴(kuò)增條件如下94°C預(yù)變性2分鐘，繼之進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，包括94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，最后72°C延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移10mLPCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入ImLLCGreenPlus染料(IdahoTechnology,USA)后，最后以HRMinCFX96實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)ClOOOThermalCycler(Bio-Rad,USA)ii行檢測。樣本先95°C變性30s，再迅速冷卻到40°C30s，然后以0.3°C/s速率從55°C升溫至90°C熔化,熔化曲線用Bio-RadPrecision分析軟件進(jìn)行分析(Bio-Rad,USA)。所述rs6887695引物序列為:正向SEQIDNO:1，反向SEQIDNO:2;非標(biāo)記C3阻斷探針序列=SEQIDN0:3。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率(MAF)在病例組與正常組之間的差異來分析SNP是否與疾病相關(guān)以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡。用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度。Z7值小于0.05認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法基于C3阻斷探針的高分辨熔煉曲線法用于基因分型。如圖1所示，在探針區(qū)的衍生熔融曲線中可以清楚地區(qū)分rs6887695(G>C)單核苷酸多態(tài)性的三個(gè)基因型(GG，GC和CC)。而直接來源于PCR產(chǎn)物的衍生熔融曲線不能區(qū)分這三種基因型(圖1的右半部分)。非標(biāo)記探針可以增加HRMA的敏感性和精確性(圖1的左半部分)。對正常熔融的非標(biāo)記探針區(qū)進(jìn)行進(jìn)一步的分析后，我們可以清晰的鑒別出所有的三種基因型(圖2A)。通過減去一個(gè)異質(zhì)曲線后產(chǎn)生的差異曲線能更好的顯示不同基因型之間的差別(圖2B)。隨后，我們用這兩個(gè)探針分別檢測所有SLE病例組和正常對照組樣本。rs6887695單核苷酸多態(tài)性與SLE的相關(guān)性表I所示為SLE患者和正常人群的IL-12brs6887695基因型及等位基因頻率。SLE患者和正常對照人群的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡。SLE患者的rs6887695基因型及等位基因頻率與正常對照人群相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs6887695次等位基因?qū)LE具有保護(hù)作用(P=0.031，OR0.78,[95%Cl0.63-0.98])。表I權(quán)利要求1.一種判定中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法，其特征在于所述方法是非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟(1)基因分型取外周血基因組DNA，采用非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法鑒定其基因型；(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用卡平方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較次要等位基因頻率在病例組與正常組之間的差異來分析SNP是否與疾病相關(guān)，以及所采集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡定律結(jié)果來分析，用OR值及95%置信區(qū)間的方式表示SNP與疾病之間的關(guān)聯(lián)程度，P值小于O.05認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述中國漢族人IL-12b基因rs6887695單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)性的方法，其特征在于所述非標(biāo)記探針的高分辨率溶解曲線法是首先進(jìn)行不對稱PCR，20mL體系含基因組DNA模板20ng，fPCR緩存液，200mMdNTPs,0.5UrTaqDNA聚合酶，O.05mM正向引物，O.5mM反向引物和O.5mMC3封閉的探針。4.PCR反應(yīng)在Bio-RadS1000PCR儀上進(jìn)行；PCR擴(kuò)增條件如下94°C預(yù)變性2分鐘，繼之進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，包括94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸20s，最后72°C延伸5min；反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移10mLPCR產(chǎn)物到HR-1專用的毛細(xì)管中，再加入ImLLCGreenPlus染料后，最后以HRMinCFX96實(shí)時(shí)熒光系統(tǒng)C1000ThermalCycler進(jìn)行檢測；樣本先95°C變性30s，再迅速冷卻到40°C30s，然后以O(shè).3°C/s速率從55°C升溫至90°C熔化，熔化曲線用Bio-RadPrecision分析軟件進(jìn)行分析；