可降解塑料的生物合成

關(guān)于可降解塑料的生物合成第一節(jié)可降解塑料概述

石化工業(yè)的興起，使得石油化工合成塑料在人類生活中扮演著重要的角色，70年代以來(lái)，塑料工業(yè)得到迅猛的發(fā)展，無(wú)論工業(yè)、農(nóng)業(yè)、建筑業(yè)、還是人們的日常生活，無(wú)不與塑料密切相關(guān)。但目前所使用的化學(xué)合成塑料在自然環(huán)境中很難分解，也不會(huì)被腐蝕，燃燒處理又會(huì)產(chǎn)生有害氣體，越來(lái)越多的塑料垃圾卻對(duì)環(huán)境造成巨大的危害。

第2頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

普通塑料是以合成樹脂為主的化學(xué)合成材料。對(duì)環(huán)境污染具有以下特點(diǎn)：①污染范圍廣，江河湖泊、田野山川無(wú)處不有。②污染物增長(zhǎng)量快。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年對(duì)塑料的需求量為1億噸，傾入海洋的塑料垃圾達(dá)數(shù)10萬(wàn)噸，陸上的更是難以計(jì)數(shù)。1985年我國(guó)農(nóng)用薄膜為30萬(wàn)噸，1990年為50萬(wàn)噸，2005年，中國(guó)包裝用塑料需求量達(dá)到了500萬(wàn)噸，按30%為難以收集的一次性塑料包裝材料和制品計(jì)算，則廢棄物產(chǎn)生量達(dá)150萬(wàn)噸。我國(guó)可覆蓋地膜的面積為5億多畝，需求量已達(dá)到100萬(wàn)。第3頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天③處理難。塑料具有耐酸堿、抗氧化、難腐蝕、難降解的特性。埋地里處理百年不爛；燃燒時(shí)產(chǎn)生大量有毒氣體，如HCl、SOx、CO等。

各種塑料及相近制品在環(huán)境中被預(yù)期降解的時(shí)間制品自動(dòng)售鋁罐聚乙烯泡可處置木制筷子塑料瓶貨機(jī)杯沫杯/盤尿布（PET）時(shí)間/a＞20＞100＞500＞20＞20＞100

④回收利用難。塑料制品種類多，填料、顏料多樣，難以分揀回收再利用。

⑤生態(tài)環(huán)境危害大。地膜降低耕地質(zhì)量，農(nóng)作物植株矮小，抗病力差；殘膜隨風(fēng)飄動(dòng)，對(duì)周圍環(huán)境、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)都有很大的影響第4頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

數(shù)量如此巨大的塑料垃圾對(duì)生態(tài)和環(huán)境產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，由此引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題將日益嚴(yán)重。許多國(guó)家已開始用生物可降解塑料代替部分石油化工合成塑料，并陸續(xù)頒布了一些法規(guī)，禁用某些塑料制品。如意大利已立法規(guī)定自1991年起所有包裝用塑料都必須生物可降解，我國(guó)也開始禁用塑料方便餐盒等不可降解的塑料制品。

當(dāng)前，生產(chǎn)降解塑料的國(guó)家主要有美國(guó)、意大利、德國(guó)、加拿大、日本、中國(guó)等。第5頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

美國(guó)是開發(fā)降解塑料的主要國(guó)家之一，主要有十幾家單位，如塑料降解研究聯(lián)合體（PDRC）、生物/環(huán)境降解塑料研究會(huì)（BEOPS）等，其宗旨在于進(jìn)行有關(guān)降解材料合成、加工工藝、降解試驗(yàn)、測(cè)試技術(shù)和方法標(biāo)準(zhǔn)體系的建立。

近年日本相繼成立了生物降解塑料研究會(huì)、生物降解塑料實(shí)用化檢討委員會(huì)，日本通產(chǎn)省已將生物降解塑料作為繼金屬材料、無(wú)機(jī)材料、高分子材料之后的“第四類新材料”。

歐洲Bhre-Eurae更是對(duì)生物降解塑料建立了完善的降解評(píng)價(jià)體系。第6頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

生物降解塑料是指在自然環(huán)境下通過(guò)微生物的生命活動(dòng)能很快降解的高分子材料。按其降解特性可分為完全生物降解塑料和生物破壞性塑料。按其來(lái)源則可分為天然高分子材料、微生物合成材料、化學(xué)合成材料、摻混型材料等。

天然高分子型是利用淀粉、纖維素、甲殼質(zhì)、蛋白質(zhì)等天然高分子材料制備的生物降解材料。這類物質(zhì)來(lái)源豐富，可完全生物降解，而且產(chǎn)物安全無(wú)毒性，日益受到重視。

美國(guó)Warner-Lambert公司開發(fā)了由70%支鏈淀粉和30%直鏈淀粉制成的新型樹脂，有良好的生物降解性，可替代農(nóng)業(yè)上使用的各種生物降解材料。第7頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在眾多的生物可降解材料中，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的聚β-羥基烷酸（簡(jiǎn)稱PHAs），成為應(yīng)用環(huán)境生物學(xué)方面的一個(gè)研究的熱點(diǎn)。其中，β-羥基丁酸（簡(jiǎn)稱PHB）及3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物[簡(jiǎn)稱P(3HB-co-3HV)或PHBV]是PHAs族中研究和應(yīng)用最廣泛的兩種多聚體。

聚β-羥基烷酸（PHAs）作為一種有光學(xué)活性的聚酯，除具有高分子化合物的基本特性，如質(zhì)輕、彈性、可塑性、耐磨性、抗射性等外，更重要的是它還具有生物可降解性和生物可相容性。第8頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

已有研究表明，采用PHAs制作的香波瓶，在自然環(huán)境中9個(gè)月后，可基本上被完全降解，而同樣用合成塑料制作的物品，完全降解時(shí)間約需100年。因此，研究和開發(fā)聚β-羥基烷酸（PHAs），使之成為同類用途的石化合成塑料最有潛在的替代品，可避免或減少塑料廢物對(duì)環(huán)境的污染，具有深遠(yuǎn)的環(huán)境意義。第9頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)PHAs的結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用OCHCH2C

nORR為甲基時(shí)，單體為β-羥基丁（HB）；R為乙基時(shí)，單體為β-羥基戊酸（HV）；R為丙基時(shí)，單體為β-羥基己酸（HC）；R為丁基時(shí)，單體為β-羥基庚酸（HH）；n為單體的數(shù)目。R為甲基時(shí)，其聚合物為β-羥基丁酸（PHB），R為乙基時(shí)，其聚合物為β-羥基戊酸（PHV）；其他依次類推。PHAs的通式可寫成：第10頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

多種微生物在一定條件下能在細(xì)胞內(nèi)積累聚β-羥基烷酸（PHAs）作為碳源和能源的貯存物。

我們采用溶劑法從不同細(xì)菌中可以提取這些多聚物，有些多聚物的相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)2×106。

每個(gè)PHA顆粒含有數(shù)千條多聚體鏈。這些多聚物的物理化學(xué)性質(zhì)和機(jī)械性能如韌度、脆性、熔點(diǎn)、玻璃態(tài)溫度和抗溶劑性等與單體的組成有極大的關(guān)系。例如3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的（PHBV）共聚物中β-羥基戊酸組分的增加可使熔點(diǎn)從180oC（PHB）降至75oC。第11頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

多數(shù)有關(guān)細(xì)菌聚β-羥基烷酸（PHAs）的物理化學(xué)性質(zhì)的研究是針對(duì)β-羥基丁酸（PHB）及3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的共聚物（PHBV）兩種聚合物進(jìn)行的。

PHB是高度結(jié)晶的晶體，其物理性質(zhì)以及分子結(jié)構(gòu)上與聚丙烯（PP）很相似，例如熔點(diǎn)、玻璃態(tài)溫度、結(jié)晶度、抗張強(qiáng)度等，而PHB具有相對(duì)密度大、透氧率低和抗紫外線照射以及具有光學(xué)活性、阻濕性和壓電性等優(yōu)點(diǎn)。

聚β-羥基烷酸（PHAs）的生物降解性和生物相容性是許多化學(xué)合成塑料所不具備的。PHAs這類熱塑性聚酯能紡絲、壓膜或注塑，在工業(yè)上可用作各類包裝材料等，在醫(yī)藥方面的應(yīng)用由于有生物相容性的特點(diǎn)，可作外科縫線、骨骼代用品或骨板，手術(shù)后無(wú)需取出。第12頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

研究還發(fā)現(xiàn)PHB的降解產(chǎn)物D(-)-3-羥基丁酸是所有高等動(dòng)物中的一種普遍存在的中間產(chǎn)物，在原核生物和真核生物中發(fā)現(xiàn)的含有100-200個(gè)單體的小分子量PHB，具有作為細(xì)胞膜離子通道組成的作用，并且在人體的血漿中也檢測(cè)到它的大量存在。所以，植入哺乳動(dòng)物組織的β-羥基丁酸（PHB）不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒性。

表8-2-2PHAs的應(yīng)用

應(yīng)用范圍PHAs的應(yīng)用

外科縫線、肘釘、拭子等；傷口敷料；血管替代品；骨骼替代品和骨

醫(yī)藥上

板（由于壓電效應(yīng)能促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)）；

長(zhǎng)效藥物的生物降解載體長(zhǎng)效除莠劑、抗真菌劑、殺蟲劑；

肥料等的生物降解載體；容器、瓶、

工業(yè)上

袋、薄膜等包裝材料；婦女衛(wèi)生用品、尿布等；合成手性化合物的前體原料第13頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)PHAs的生物合成一、合成PHAs的主要微生物二、合成PHAs的主要基質(zhì)三、PHAs的代謝途徑與調(diào)控第14頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、合成PHAs的主要微生物

能產(chǎn)生聚β-羥基烷酸（PHAs）微生物分布極廣，包括光能和化能自養(yǎng)及異養(yǎng)菌，計(jì)65個(gè)屬中的近300種微生物。

目前研究較多的用于合成PHAs的微生物有：產(chǎn)堿桿菌屬，假單胞菌屬，甲基營(yíng)養(yǎng)菌，固氮菌屬和紅螺菌屬等。它們能分別利用不同的碳源產(chǎn)生不同的PHAs。

在多數(shù)情況下微生物能利用糖加丙酸或戊酸產(chǎn)生PHBV的，并可通過(guò)改變兩者的配比控制共聚物中HB和HV的比例。但丙酸或戊酸價(jià)格高，且對(duì)細(xì)菌有毒，因而在培養(yǎng)液中的濃度必須控制很低，產(chǎn)率及轉(zhuǎn)化率都不高，這些也是生產(chǎn)上的不利因素。第15頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

上個(gè)世紀(jì)90年代以來(lái)發(fā)現(xiàn)，在分類上屬于紅球菌屬、諾卡氏菌屬和棒桿菌屬中的一些菌能利用葡萄糖或其他單一碳源產(chǎn)生含HB和HV的PHA。

上個(gè)世紀(jì)末，有人觀察到真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16的異亮氨酸缺陷型突變株R8能從單一的無(wú)關(guān)連碳源例如果糖或葡萄糖酸等產(chǎn)生PHBV。以果糖為碳源時(shí)，共聚物占細(xì)胞干重的47%。這些發(fā)現(xiàn)不僅給PHA生物合成和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究增加了新的內(nèi)容，而且對(duì)探索從廉價(jià)的單一碳源生產(chǎn)PHBV方面開辟了一條新的途徑。第16頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

選擇工業(yè)生產(chǎn)PHAs的菌種可以考慮以下幾個(gè)因素，主要包括細(xì)菌能利用廉價(jià)碳源的能力、生長(zhǎng)速率、多聚物合成速率和能在細(xì)胞內(nèi)最大積累多聚物的程度。

如英國(guó)ICI公司分別對(duì)固氮菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌和真氧產(chǎn)堿桿菌進(jìn)行了考察：

首先，放棄了固氮菌、因?yàn)檫@類菌還會(huì)產(chǎn)生多糖，從而降低了β-羥基丁酸（PHB）的產(chǎn)率。

其次，否定了甲基營(yíng)養(yǎng)菌，這類菌的PHB產(chǎn)率不高，胞內(nèi)PHB含量?jī)H為65%左右。

第三，舍去了甲醇，雖然甲醇的價(jià)格低，但轉(zhuǎn)化系數(shù)也低，

經(jīng)考察，最終選擇了真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌作為PHAs的生產(chǎn)菌株，因?yàn)樵摼晟L(zhǎng)快、易培養(yǎng)、胞內(nèi)PHB含量高、聚合物的分子量大以及能利用各種較經(jīng)濟(jì)的碳源。第17頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、合成PHAs的主要基質(zhì)

1.糖質(zhì)碳源

可用來(lái)工業(yè)化生產(chǎn)PHA的糖質(zhì)碳源有葡萄糖、蔗糖、糖蜜、淀粉等。

（1）葡萄糖真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌野生株H16利用果糖積累PHB，其利用葡萄糖的變異株已用于工業(yè)生產(chǎn)PHB。

如凱姆等人采用細(xì)胞密度培養(yǎng)的方法，通過(guò)在線葡萄糖濃度的控制，首先使菌體平衡生長(zhǎng)至70g/L，再讓其積累PHB，50h細(xì)胞濃度達(dá)164g/L，干細(xì)胞中PHB含76%，發(fā)酵液中含量為121g/L，PHB的生產(chǎn)強(qiáng)度為2.42g/（L·h），是目前世界上已報(bào)道的最高記錄。第18頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）蔗糖及糖蜜

肥大產(chǎn)堿桿菌能利用蔗糖積累β-羥基丁酸（PHB），采用分批補(bǔ)料培養(yǎng)的方法積累的PHB量達(dá)60g/L以上，目前已中試生產(chǎn)的水平為15m3反應(yīng)器每周生產(chǎn)1tPHB。該菌的特點(diǎn)是生長(zhǎng)較快，能利用廉價(jià)的甜菜或甘蔗糖蜜，并且細(xì)胞生長(zhǎng)與PHB的積累同步。

但是，使用糖蜜作基質(zhì)還很有爭(zhēng)議。培格認(rèn)為，用甜菜糖蜜作基質(zhì)其價(jià)格是葡萄糖的1/2，而ICI公司認(rèn)為糖本身雖然價(jià)格較低，但雜質(zhì)多，增加了PHB積累的難度，為了提高PHB含量，糖蜜原料需精制，這就增加了成本。另外，使用糖蜜還會(huì)給后提取增加困難（如粘度大，需脫色等），糖蜜系季節(jié)性產(chǎn)品，儲(chǔ)運(yùn)不易，再有糖蜜含糖量較低（通常含糖50%以下），如用來(lái)作細(xì)胞的高密度培養(yǎng)還需補(bǔ)加純糖，這也會(huì)影響成本，所以從使用糖蜜的總效益綜合考慮，盡管糖蜜本身廉價(jià)，用于實(shí)際生產(chǎn)上仍有許多困難需要克服。第19頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2.甲醇

甲醇是最便宜的基質(zhì)之一，但由于甲醇菌積累PHB含量不高，加大了PHB回收過(guò)程的成本，而且PHB的分子量較小，故ICI公司放棄了這條路線。但由于甲醇價(jià)格低，仍然吸引人們尋求新的菌種和開發(fā)更有效的培養(yǎng)方法。

凱姆等使用嗜有機(jī)甲基桿菌，在微機(jī)輔助的自動(dòng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)系統(tǒng)中，在限鉀的條件下（＜25mg/L）大量生產(chǎn)PHB，甲醇濃度維持在2-3g/L時(shí)不抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，培養(yǎng)70h細(xì)胞濃度高達(dá)250g/L，是當(dāng)今高密度培養(yǎng)產(chǎn)PHB細(xì)胞濃度的最高記錄。第20頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3．氣體H2/CO2/O2

真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌等一些爆鳴氣細(xì)菌能利用H2/CO2/O2產(chǎn)生β-羥基丁酸（PHB），其中H2作為能源，CO2是碳源。

H2是一種干凈的可再生資源。通過(guò)同化CO2生產(chǎn)生物降解塑料，可以同時(shí)解決溫室效應(yīng)及廢棄的非降解塑料的危害等兩個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題。但在技術(shù)上要解決混合氣體爆鳴的安全問(wèn)題和氣體的循環(huán)利用問(wèn)題。

控制基質(zhì)氣相中氧的濃度低于氣體爆炸的下限（6.9%）是安全的，而循環(huán)氣體的閉路培養(yǎng)體系能有效地利用氣體。

田中等人研究了真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌利用H2/CO2/O2的高密度培養(yǎng)產(chǎn)PHB的最新結(jié)果是，在限氧條件下培養(yǎng)40h，細(xì)胞濃度和PHB濃度分別達(dá)到91.3g/L和61.9g/L。第21頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．烷烴及其衍生物

假單胞菌能利用中等鏈長(zhǎng)的烷烴或其衍生物醇、酸等產(chǎn)生中等鏈長(zhǎng)羥基烷酸的共聚物（PHAMCL），而共聚物中單體的組成與基質(zhì)碳架的長(zhǎng)度有關(guān)。

以辛烷作基質(zhì)連續(xù)培養(yǎng)食油假單胞菌，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和增加氧的轉(zhuǎn)移率，穩(wěn)定態(tài)細(xì)胞濃度增至11.6

g/L，用傳氧很有效的反應(yīng)器作分批補(bǔ)料培養(yǎng)，38h細(xì)胞濃度為37.1g/L，PHA占細(xì)胞干重的33%。

如通純氧以適應(yīng)細(xì)胞對(duì)氧的需要、用辛酸分批補(bǔ)料培養(yǎng)45h，細(xì)胞濃度為41.8g/L，PHA占細(xì)胞干重的37.1%。第22頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、PHAs的代謝途徑與調(diào)控

研究表明，許多微生物在碳源過(guò)量而其他某種營(yíng)養(yǎng)成分，如氮、磷、鎂或氧不足時(shí)，能在細(xì)胞內(nèi)大量積累聚β-羥基烷酸，以作為碳源和能源的貯存物。

當(dāng)限制性營(yíng)養(yǎng)物再次被提供時(shí)，PHAs能被細(xì)胞內(nèi)酶降解后作為碳源和能源利用。細(xì)胞中積累的PHAs以單個(gè)粒子的形態(tài)存在，不同微生物細(xì)胞含有的顆粒數(shù)量及顆粒大小不同。

在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中，每個(gè)細(xì)胞含有8~10個(gè)顆粒，每個(gè)顆粒直徑大小為0.2~0.5μm。

在電子顯微鏡中觀察到這些內(nèi)含物具有高度的折光性，顆粒外面包裹著一層膜，該膜沒有生物膜那樣的典型雙層結(jié)構(gòu)，膜中含有PHAs合成酶的降解酶系統(tǒng)。

第23頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

PHAs除在微生物饑餓條件下作為碳源和能源外，還為微生物在其他環(huán)境壓力條件下（如滲透壓、脫水或紫外線照射）的生存起著重要的作用。

一般說(shuō)來(lái)，在惡劣環(huán)境下含有PHAs的細(xì)胞微生物比不含PHAs的細(xì)胞具有更高的存活率。最近研究發(fā)現(xiàn)，PHAs除了作為細(xì)胞內(nèi)貯物的生理作用外，還是細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)化合物。

不同微生物合成PHAs的途徑不同，基質(zhì)不同，其合成途徑也有差異，這是微生物代謝多樣性的一種表現(xiàn)。第24頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在不同微生物中，利用不同基質(zhì)合成PHA的主要途徑包括：（1）真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌及多數(shù)細(xì)菌利用糖作為基質(zhì)合成PHB;（2）深紅紅螺菌利用糖作為基質(zhì)合成PHB;

（3）食油假單胞菌等利用中鏈烴、醇及酸合成具有與基質(zhì)鏈長(zhǎng)有關(guān)的HA單位的PHA；（4）一株產(chǎn)堿桿菌利用長(zhǎng)鏈偶碳數(shù)脂肪酸合成PHB;（5）銅綠假單胞菌等利用糖質(zhì)碳源合成具有中鏈HA單位的PHA;

（6）真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌等利用糖加丙酸合成PHBV。

第25頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌以及許多微生物中，PHB是從已酰CoA通過(guò)三步反應(yīng)合成。

一是由生物合成的β-酮基硫酯酶催化兩個(gè)已酰CoA的c—c結(jié)合；二是由依賴NADPH的已酰已酰CoA還原酶催化產(chǎn)生D(-)3-羥基丁酰CoA

；三是由PHB聚合酶將D(-)3-羥基丁酰CoA連接到PHB正在增長(zhǎng)的鏈上。第26頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第四節(jié)PHAs的發(fā)酵生產(chǎn)一、PHAs的流加發(fā)酵二、PHB發(fā)酵過(guò)程中理論產(chǎn)率的計(jì)算第27頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、PHAs的流加發(fā)酵

阻礙聚β-羥基烷酸（PHAs）實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要障礙是生產(chǎn)成本問(wèn)題。影響PHAs生產(chǎn)成本的主要因素有菌種、原料、操作方式以及提取方法等。所以，降低PHAs的生產(chǎn)成本主要考慮以下幾點(diǎn)：

其一，采用廉價(jià)基質(zhì)（如CO2、H2和O2或甲醇、乙醇、葡萄糖及來(lái)自農(nóng)業(yè)廢物的有機(jī)酸等）和提高最終產(chǎn)物對(duì)基質(zhì)的產(chǎn)率系數(shù)，以降低發(fā)酵原材料的成本。其二，提高生產(chǎn)強(qiáng)度（如選育高產(chǎn)菌株，采用合適的發(fā)酵生產(chǎn)方式等），以降低操作成本。

其三，改進(jìn)提取、純化技術(shù)（如不采用價(jià)格昂貴的有機(jī)溶劑、簡(jiǎn)化操作等），以降低提取成本。第28頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

除上述3點(diǎn)外，還應(yīng)采用適宜的發(fā)酵生產(chǎn)方式，這是提高聚合物的生產(chǎn)率和改進(jìn)其質(zhì)量的關(guān)鍵。

現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，絕大多數(shù)的培養(yǎng)均采用純種液體培養(yǎng)方法，液體培養(yǎng)的操作方法主要有間歇（分批）培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)和流加培養(yǎng)3種。①細(xì)胞的分批培養(yǎng)是一種間歇培養(yǎng)方式。在培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)系統(tǒng)除了需不斷進(jìn)行通氣和加入酸堿溶液以及排出廢氣外，與外界沒有其他的物料交換。在分批培養(yǎng)中，細(xì)胞濃度、基質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度均不斷發(fā)生變化。第29頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

②連續(xù)培養(yǎng)的方法是將新鮮的培養(yǎng)基連續(xù)地加入有均勻培養(yǎng)液的反應(yīng)器中，同時(shí)排出發(fā)酵液，使培養(yǎng)環(huán)境如底物濃度、產(chǎn)物濃度、細(xì)胞濃度、比生長(zhǎng)速率等可不隨時(shí)間變化而變化，保持培養(yǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)。在連續(xù)培養(yǎng)中，任何一種營(yíng)養(yǎng)成分都可以用作限制性底物。

③所謂流加培養(yǎng)，又稱半連續(xù)發(fā)酵，是指在培養(yǎng)過(guò)程中不斷向反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)基，但不同時(shí)取出培養(yǎng)液的培養(yǎng)方法。它是一種介于分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)之間的培養(yǎng)方法。兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)，而又克服了兩者的缺點(diǎn)。和傳統(tǒng)的分批培養(yǎng)相比，流加培養(yǎng)可以解除底物抑制、葡萄糖效應(yīng)、代謝阻遏等；與連續(xù)培養(yǎng)相比，流加培養(yǎng)的染菌可能性小，也不易產(chǎn)生菌種老化變異等。第30頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

所謂限制性底物，是指在培養(yǎng)微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中，對(duì)微生物的生長(zhǎng)起到限制作用的營(yíng)養(yǎng)物。

由于許多微生物只有在氮、磷或氧等缺乏而碳源過(guò)量的不平衡生長(zhǎng)條件下才能大量積累PHAs，所以在PHAs的發(fā)酵生產(chǎn)中，一般可將發(fā)酵過(guò)程分成兩個(gè)階段來(lái)進(jìn)行控制：第一階段為菌體細(xì)胞的形成階段，在此階段微生物利用基質(zhì)形成大量菌體，而多聚體PHAs的積累量很少；

第二階段為多聚體形成階段，在此階段PHAs大量形成而菌體細(xì)胞基本上不繁殖。第31頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在簡(jiǎn)單分批培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)菌體生長(zhǎng)進(jìn)行到一定濃度時(shí)，培養(yǎng)基中一種或幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度可能成為菌體細(xì)胞進(jìn)一步繁殖的限制因素，而簡(jiǎn)單地增加該種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的初始濃度不可能導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)量的相應(yīng)增加，相反某些成分在較高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒害作用，另一些還可能形成沉淀，因而采用分批發(fā)酵法不能獲得很高的細(xì)胞干重以及高的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強(qiáng)度。

而采用流加發(fā)酵法進(jìn)行PHAs的生產(chǎn)時(shí)，就可以在某些必需的營(yíng)養(yǎng)成分成為生長(zhǎng)限制因素之前，對(duì)其進(jìn)行定量流加，延長(zhǎng)細(xì)胞的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，從而可獲得較高的菌體濃度。第32頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（一）采用流加培養(yǎng)法生產(chǎn)PHB

在實(shí)際應(yīng)用中，通常選擇限制培養(yǎng)基中的氮源作為流加控制的手段，因?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)對(duì)氮源的依賴比對(duì)其他離子更強(qiáng)，微生物對(duì)氮源的同化作用也比其他離子更快。

研究發(fā)現(xiàn)，在流加培養(yǎng)過(guò)程中，控制恰當(dāng)?shù)奶嫉认喈?dāng)重要。為什么？在PHB合成階段開始時(shí)，采用較低的碳氮比可以保持細(xì)胞具有較高的PHB合成能力，隨著胞內(nèi)PHB含量的增加，微生物細(xì)胞的PHB合成能力下降，這時(shí)可逐漸增加培養(yǎng)基中的碳氮比。第33頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在流加培養(yǎng)過(guò)程中，可以通過(guò)在線檢測(cè)尾氣中CO2濃度，來(lái)間接估計(jì)胞內(nèi)PHB含量，達(dá)到適時(shí)控制培養(yǎng)過(guò)程中碳氮比的目的。

真氧產(chǎn)堿桿菌A.eutrophus是到目前為止對(duì)其動(dòng)力學(xué)和代謝途徑研究得較為透徹的、也是唯一已用于工業(yè)過(guò)程來(lái)生產(chǎn)多聚體的一類微生物，此菌能利用多種基質(zhì)如葡萄糖、果糖、乙酸、丁酸或H2、O2和CO2的混合氣體等來(lái)合成PHB。第34頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

通過(guò)對(duì)真氧產(chǎn)堿桿菌其生長(zhǎng)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在菌體生長(zhǎng)階段和PHB形成階段之間存在一短暫的過(guò)度階段，此過(guò)程階段在氮源耗盡的同時(shí)形成，僅維持不到一個(gè)世代時(shí)間，此時(shí)，殘留菌體和蛋白質(zhì)的形成速率降為零，并且它們的含量在隨后的時(shí)間內(nèi)保持恒定，而PHB的形成速率迅速達(dá)到最大值，隨后逐漸下降至最終為零。很明顯，在以氮源為限制條件的PHB形成過(guò)程中，限量添加氮源能促進(jìn)PHB的積累，這些結(jié)果與前面提到的用甲基營(yíng)養(yǎng)菌合成PHB的情況相一致，在PHB形成階段維持很低濃度的氮源時(shí)，PHB的形成速率比不加氮源的情況要高。第35頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）采用流加培養(yǎng)法生產(chǎn)共聚物P（HB-co-HV）

由3-羥基丁酸和3-羥基戊酸聚合而成的共聚物P（HB-co-HV）是瓦爾恩等人在1974年從活性污泥的絮凝物中分離出的第一個(gè)共聚物，也是目前最具工業(yè)前景和吸引力的共聚物。

在共聚物P（HB-co-HV）的生產(chǎn)過(guò)程中，流加發(fā)酵操作比分批發(fā)酵具有明顯優(yōu)勢(shì)。為什么？丙酸或戊酸是生產(chǎn)共聚物P（HB-co-HV）所必需的基質(zhì)，由于這些有機(jī)酸對(duì)菌體細(xì)胞具有一定的毒性，采用流加培養(yǎng)法，可避免由于培養(yǎng)基中有機(jī)酸的積累而使細(xì)胞活力受到損害，從而達(dá)到提高P（HB-co-HV）產(chǎn)率的目的。第36頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

除3-羥基丁酸外，現(xiàn)在已知有40多種不同的脂肪酸可作為PHAs的組成成分。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)能積累PHB的微生物也具有積累共聚物P（HB-co-HV）的能力，而且各種微生物從有機(jī)酸合成共聚物P（HB-co-HV）的途徑和對(duì)有機(jī)酸的耐受能力也各不相同。

由于所用的合成共聚物的基質(zhì)（如丙酸或戊酸）價(jià)格相對(duì)較昂貴，如果丙酸在代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)向產(chǎn)能或形成乙酰CoA，進(jìn)而形成HB單體，將會(huì)使共聚物中HV單體的含量下降而導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加。第37頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

除丙酸和戊酸能被作為生產(chǎn)共聚物P（HB-co-HV）的基質(zhì)外，最近得到的由真氧產(chǎn)堿桿菌A.eutrophus異亮氨酸缺陷型突變株自發(fā)轉(zhuǎn)變成的光養(yǎng)株R3，能從單一的如葡萄糖或果糖等無(wú)關(guān)聯(lián)碳源產(chǎn)生共聚物P（HB-co-HV）。

例如以果糖為碳源時(shí)，共聚物占細(xì)胞干重的47%，HV單體含量7%，這些發(fā)現(xiàn)，一方面給PHAs生物合成和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究增加了新的內(nèi)容，同時(shí)，也開辟了一條探索從廉價(jià)的單一碳源生產(chǎn)共聚物P（HB-co-HV）的新路。第38頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）流加培養(yǎng)條件對(duì)多聚體相對(duì)分子質(zhì)量分布的影響多聚體的相對(duì)分子質(zhì)量常常影響其質(zhì)量和生物降解的速率。一般平均相對(duì)分子質(zhì)量大且相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍窄的多聚體具有更廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，并且提取也較方便，而對(duì)于某些特殊用途，相對(duì)分子質(zhì)量不宜超過(guò)1×105。

多聚體的平均相對(duì)分子質(zhì)量大小受流加培養(yǎng)條件的影響。當(dāng)培養(yǎng)條件恒定時(shí)，其平均相對(duì)分子質(zhì)量也可以保持恒定，因而只要控制適宜的流加培養(yǎng)條件，就可將其相對(duì)分子質(zhì)量控制在所需的范圍之內(nèi)。第39頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

蘇祖凱等人對(duì)假單胞菌屬的微生物以甲醇為基質(zhì)合成PHB時(shí)的培養(yǎng)條件（如溫度、pH、甲醇濃度等）進(jìn)行了研究。

發(fā)現(xiàn)溫度會(huì)影響PHB的形成速率和含量，但對(duì)其聚合度沒有影響；

pH值對(duì)聚合物平均相對(duì)分子質(zhì)量的影響很??；

在流加培養(yǎng)過(guò)程中，甲醇濃度對(duì)多聚體平均相對(duì)分子質(zhì)量的大小有顯著影響。

當(dāng)甲醇濃度很低（如0.5g/L）時(shí)，其平均相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)8×105，當(dāng)甲醇濃度很高（如32g/L）時(shí)，其平均相對(duì)分子質(zhì)量小于0.5×105。第40頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

除采用改變流加培養(yǎng)中基質(zhì)濃度的方法來(lái)改變聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量大小外，另一個(gè)方法是利用細(xì)胞內(nèi)PHB的不平衡降解來(lái)改變其相對(duì)分子質(zhì)量分布。

細(xì)胞積累多聚體是為其在惡劣環(huán)境下生存所用，因而，如果在培養(yǎng)過(guò)程中的某一階段僅添加氮源而不加碳源，PHB就會(huì)被細(xì)胞降解，作為能源加以利用，而且，低分子量聚合物的降解速率大于高分子量聚合物的降解速率。這可使PHB的平均相對(duì)分子質(zhì)量轉(zhuǎn)換至較高的值。

為了獲得更均質(zhì)的共聚體，在共聚物P（HB-co-HV）的積累階段開始時(shí)，應(yīng)先使培養(yǎng)物處于碳源饑餓狀態(tài)，這樣可使細(xì)胞內(nèi)源PHB的量大大降低，得到的共聚物P（HB-co-HV）就較為均一。第41頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、PHB發(fā)酵過(guò)程中理論產(chǎn)率的計(jì)算

PHB是僅有C、H和O元素組成的多聚物，在合成PHB所需的基質(zhì)中，碳源的消耗量最大，所占發(fā)酵原料成本的比例也最大，因而，產(chǎn)物PHB對(duì)碳源的產(chǎn)率Yp/c，是影響PHB工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的重要因素。

PHB發(fā)酵過(guò)程的理論產(chǎn)率和總產(chǎn)率：從簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)角度考慮很容易推斷，在假定沒有非PHB部分的殘留菌體合成時(shí)，產(chǎn)物PHB對(duì)碳源的產(chǎn)率Yp/c，可達(dá)到最大值，該最大值被命名為PHB對(duì)碳源的理論產(chǎn)率Yp/c；

當(dāng)考慮到在平衡生長(zhǎng)階段形成菌體所消耗的碳源時(shí)，該實(shí)際產(chǎn)率Y1p/c，稱為總產(chǎn)率。第42頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

通常有兩種不同的方法來(lái)計(jì)算理論產(chǎn)率，即化學(xué)計(jì)算法和生化計(jì)算法。

在生化計(jì)算法中，必須仔細(xì)考慮合成PHB過(guò)程的代謝途徑和輔酶的再循環(huán)過(guò)程。在大多數(shù)細(xì)菌中，PHB是從乙酰CoA經(jīng)3個(gè)連續(xù)的反應(yīng)而形成的，這三個(gè)反應(yīng)分別被3-酮基硫解酶、依賴于NADPH的乙酰乙酰CoA還原酶和PHB合成酶所催化。

必須注意到乙酰乙酰CoA還原酶是與NADPH相關(guān)連的，即該酶僅催化下列反應(yīng)：

乙酰-CoA+NADPH+H+

→D-3-羥基丁酰CoA+NADP+（1式）第43頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

盡管在PHB合成途徑的3個(gè)反應(yīng)中，即不需要NAD+也不需要ATP，但必須考慮包括PHB生物合成途徑在內(nèi)的所有途徑中NAD+/NADH和ATP/ADP的再循環(huán)，這些輔助基質(zhì)的缺乏不可能使代謝中間產(chǎn)物順利流動(dòng)。

NADP+通過(guò)6-磷酸葡萄糖脫氫酶再生，細(xì)胞內(nèi)PHB合成的凈反應(yīng)如下：

葡萄糖+（3p+1）ADP+（3p+1）Pi+（3/2）O2→（1/n）PHB+2CO2+3H2O+（3p+1）ATP（2式）式中p是P/O比率，從該反應(yīng)式中可以計(jì)算出PHB對(duì)基質(zhì)葡萄糖的理論產(chǎn)率為：YP/C=86/180=0.48第44頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

總的產(chǎn)率是從實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中計(jì)算出來(lái)的，PHB在細(xì)胞生長(zhǎng)停止后積累或部分在細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)積累。

假定所消耗的總碳量（-△St），分成兩部分，合成PHB所耗部分為（-△S1），合成非PHB的菌體所消耗的部分為（-△S2），則有：

（-△St）=（-△S1）+（-△S2）（3式）第45頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天第五節(jié)PHAs的提取技術(shù)PHB的提取技術(shù)主要涉及到兩個(gè)問(wèn)題：

一是方法的合理性，主要表現(xiàn)在提取率、產(chǎn)物的純度，提取過(guò)程是否對(duì)PHB的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)放大的可行性，以及操作是否方便，預(yù)、后處理是否復(fù)雜，環(huán)境污染程度等。

二是過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，表現(xiàn)在提取所用材料費(fèi)用、能量消耗以及設(shè)備投資等。

由于PHB以顆粒狀態(tài)存在于細(xì)胞中，分離提取比較困難，所以，探索PHB的提取方法以降低提取成本具有十分重要的意義。第46頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、有機(jī)溶劑法

有機(jī)溶劑包括：氯仿、二氯乙烷、1,1,2-三氯乙烷、碳酸乙烯酯及碳酸丙烯酯等。

其基本原理是，這些有機(jī)溶劑一方面能改變細(xì)胞壁和膜的通透性，另一方面能使PHB溶解到溶劑中，而非PHB的細(xì)胞物質(zhì)不能溶解，從而將PHB與其他物質(zhì)分離開來(lái)。第47頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天

用有機(jī)溶劑的方法進(jìn)行提取得到的PHB純度可達(dá)到很高，但存在以下缺點(diǎn)：（1）當(dāng)溶劑中含有超過(guò)50g/L的PHB時(shí)，溶液變得很粘，要去掉細(xì)胞的殘余物很困難；

（2）即使經(jīng)過(guò)多次反復(fù)提取，仍有一定量的PHB存在于菌體中，所以提取率難以達(dá)到很高；

（3）使用大量的有機(jī)溶劑，盡管溶劑可回收再用，但仍造成巨大的原料消耗；

（4）大量有毒、易爆、揮發(fā)溶劑的使用，對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，給操作帶來(lái)不便。

第48頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、次氯酸鈉法

次氯酸鈉能夠破胞，而且對(duì)細(xì)胞中的非PHB的細(xì)胞物質(zhì)的消化很有效。用該方法具有破胞所得產(chǎn)品的純度較高、提取速度快等優(yōu)點(diǎn)。但由于次氯酸鈉對(duì)PHB分子有嚴(yán)重的降解作用，因此所獲得的PHB分子量小。為了克服其缺點(diǎn)，哈恩等人結(jié)合氯仿提取時(shí)PHB純度高，而且被降解程度小的特點(diǎn)，發(fā)明了用分散的次氯酸鈉/氯仿提取PHB的方法。

次氯酸鈉/氯仿的方法比單純使用氯仿提取率高，比單純使用次氯酸鈉分子量大。但此方法仍然需要使用大量有機(jī)溶劑，并且操作比較復(fù)雜，所以限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。第49頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、酶法

酶法提取PHB的原理與次氯酸鈉法類似，即讓大量的非PHB的細(xì)胞物質(zhì)溶解，而PHB不溶解，從而達(dá)到分離、提純的目的。

由于非PHB的細(xì)胞物質(zhì)通常包括蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，實(shí)際上是通過(guò)多種酶的協(xié)同作用來(lái)達(dá)到消化非PHB的細(xì)胞物質(zhì)。

單純使用酶來(lái)消化細(xì)胞中的雜質(zhì)成分，所得PHB的純度不高，需結(jié)合其他的方法，如再用表面活性劑處理，可得到較高純度的PHB。酶法提取PHB，其提取成本較高、處理過(guò)程較復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中仍然受到很大限制。第50頁(yè),共57頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、表面活性劑/次氯酸鈉法

為了克服酶法提取PHB存在的操作步驟多以及酶作用條件苛刻的不足，同時(shí)為了盡量避免使用有機(jī)溶劑而用水相體系提取PHB，人們研究了用表面活性劑/次氯酸鈉法提取PHB。

用這種方法提取PHB的原理，有人認(rèn)為，在低濃度時(shí)，表面活性劑單個(gè)分子進(jìn)入到細(xì)胞膜的磷脂雙層中；隨著表面活性劑濃度的增加，更多表面活性劑分子結(jié)合到磷脂雙層中，表面