GB-T微生物誘變育種技術(shù)規(guī)范征求意見(jiàn)稿編制說(shuō)明

一、任務(wù)來(lái)源

本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)2017年第三批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

制修訂計(jì)劃，項(xiàng)目編號(hào)“20171816-T-424”。該標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并

歸口，由清華大學(xué)等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義

微生物自發(fā)突變頻率狠低，正突變頻率更低，通過(guò)自然選育提高菌種生產(chǎn)能

力、篩選高產(chǎn)菌株的效率較低，效果不明顯。因此在生產(chǎn)實(shí)踐中，以人工誘變基

因突變?yōu)榛A(chǔ)的誘變育種是微生物育種的主要方法，尤其發(fā)酵工業(yè)中的各種優(yōu)良

高產(chǎn)菌株絕大部分都是以誘變育種方法獲得的。

化學(xué)誘變和紫外誘變是傳統(tǒng)的誘變育種方法，應(yīng)用范圍廣，誘變效果顯著；

ARTP誘變是新興的誘變方法，與化學(xué)誘變和紫外誘變相比更安全、高效。三種

方法各有利弊，實(shí)際生產(chǎn)中往往需要結(jié)合不同的誘變方法，通過(guò)多輪誘變來(lái)獲得

高性能的菌株。此標(biāo)準(zhǔn)編制旨在規(guī)范這三種誘變方式的實(shí)驗(yàn)方法，以更好的推動(dòng)

微生物誘變育種行業(yè)的發(fā)展。

三、標(biāo)準(zhǔn)制訂原則和依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)參考了其他同類國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，同時(shí)充分考慮我國(guó)微生物誘變育種

的使用經(jīng)驗(yàn)和要求。

（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和

編寫規(guī)則》的有關(guān)要求。

2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考我國(guó)與誘變相關(guān)的文件、標(biāo)準(zhǔn)，包括

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T27831-2011化學(xué)品遺傳毒性釀酒酵母菌基因突變?cè)囼?yàn)方法

GB/T21793-2008化學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)方案

四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

1

（一）標(biāo)準(zhǔn)適用范圍說(shuō)明

本標(biāo)準(zhǔn)方法屬于生物技術(shù)范疇，主要用于微生物化學(xué)、物理誘變育種。規(guī)定

了微生物誘變育種的術(shù)語(yǔ)和定義、基本要求和操作步驟。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于紫外線、等離子體和化學(xué)誘變劑等誘變方法對(duì)微生物進(jìn)行誘變

育種的實(shí)驗(yàn)操作流程。

（二）內(nèi)容提要

規(guī)定了紫外誘變、化學(xué)誘變和ARTP誘變的原理和適用范圍、誘變材料的準(zhǔn)

備、誘變條件的選擇和操作步驟。

五、主要工作過(guò)程

2016年接到編制任務(wù)，開(kāi)展資料收集和分析工作。研究了GB/T27831-2011

《化學(xué)品遺傳毒性釀酒酵母菌基因突變?cè)囼?yàn)方法》、GB/T21793-2008《化

學(xué)品體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)方案》了解了突變?cè)囼?yàn)的相關(guān)要求，同時(shí)

收集了紫外誘變、等離子體誘變、化學(xué)誘變期刊文章，總結(jié)各種誘變的操作規(guī)范。

了解微生物誘變應(yīng)用范圍、處理?xiàng)l件基本情況。

利用本課題組自主研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變育種儀（ARTP）建立了等

離子體誘變的操作方法，并誘變了大腸桿菌，得到了致死率隨ARTP照射時(shí)間的

變化。

為了使編制的標(biāo)準(zhǔn)能更好的適用微生物誘變育種應(yīng)用，同時(shí)有效地促進(jìn)誘變

育種效率的提高，在2016年10月提出了標(biāo)準(zhǔn)討論提綱，確定了編制原則和主要

內(nèi)容。該標(biāo)準(zhǔn)于2017年10月在全國(guó)標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺(tái)上進(jìn)行公示，于2019

年2月召開(kāi)專家會(huì)，聽(tīng)取專家意見(jiàn)。

六、方法驗(yàn)證及結(jié)果

（一）紫外誘變粗狀假絲酵母

1、供試菌株：粗狀假絲酵母(Candidavalida)1444

2、誘變條件：采用功率為20W紫外燈,照射距離為30cm,照射時(shí)間為0、

2、4、6、8、10、12、14分鐘。

3、操作步驟

2

誘變處理時(shí)先打開(kāi)紫外燈,預(yù)熱20min,以穩(wěn)定波長(zhǎng)。取制好的菌懸液5ml

于直徑為7cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,內(nèi)加磁力轉(zhuǎn)子(無(wú)菌),在磁力攪拌下,開(kāi)蓋用

紫外光照射不同時(shí)間,每隔2min定時(shí)取出菌液,于冰浴中保存1h,同未經(jīng)紫

外照射的菌液用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋,每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行,涂布于普通固

體平板,用黑色膠袋包好于30℃恒溫培養(yǎng)2d,觀察不同處理時(shí)間的平板菌落數(shù),

計(jì)算致死率。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

出發(fā)菌株1444粗壯假絲酵母經(jīng)紫外線照射不同時(shí)間的致死曲線如圖1所

示，照射6min時(shí)致死率達(dá)85%，可作為后續(xù)誘變的條件。

圖1紫外誘變粗狀假絲酵母致死率曲線

（二）化學(xué)誘變樹(shù)狀多節(jié)孢

1、供試菌株：樹(shù)狀多節(jié)孢（NodulisporiumSylviforme）

2、誘變條件：誘變劑選用亞硝基胍(NTG)，誘變劑濃度為0.5mg·mL-1、1.0

mg·mL-1、2.0mg·mL-1、3.0mg·mL-1、4.0mg·mL-1、5.0mg·mL-1，誘變時(shí)間為

10min、20min、30min，誘變溫度為26～28℃。

3、實(shí)驗(yàn)步驟

用丙酮試劑將亞硝基胍溶液配制成終濃度為0.5mg·mL-1、1.0mg·mL-1、

2.0mg·mL-1、3.0mg·mL-1、4.0mg·mL-1、5.0mg·mL-1。取0.5mLNTG處

理液與4.5mL稀釋的孢子懸液混合，置于直徑6cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，開(kāi)啟磁力攪

拌器，在26～28℃條件下分別處理10min、20min、30min后，用pH為8.0

的磷酸緩沖溶液稀釋終止反應(yīng)，進(jìn)行10-1、10-2、10-3系列梯度稀釋。從每個(gè)稀

3

釋度中取0.2mL/皿涂布于加有25～30mLPDA固體培養(yǎng)基平板上，28℃避光恒

溫培養(yǎng)3～5d，計(jì)數(shù)各梯度平皿菌落數(shù)并計(jì)算致死率。每次試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果都采

用三個(gè)平行組，測(cè)試結(jié)果為各重復(fù)樣的平均值。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本試驗(yàn)應(yīng)用不同濃度NTG對(duì)紫杉醇產(chǎn)生菌原生質(zhì)體懸液進(jìn)行處理，當(dāng)其濃

度超過(guò)5.0mg·mL-1、處理15min時(shí)，紫杉醇產(chǎn)生菌HD1-3的孢子完全致死(致

死率為100%)。因此，本試驗(yàn)選定NTG溶液濃度3.0mg·mL-1、處理20min

作為適宜誘變劑量(致死率為74.6%±3.8%)（見(jiàn)表1）。

表1不同NTG溶液濃度和處理時(shí)間下原生質(zhì)體致死率

亞硝基胍濃度（mg·ml-1）時(shí)間（min）致死率（100%）

1020.7±1.8

0.51528.5±1.7

2041.3±2.3

1032.6±2.7

1.01549.3±2.5

2053.8±3.2

1047.6±2.6

2.01556.8±3.7

2067.1±3.6

1069.2±4.1

3.01574.6±4.3

2076.3±3.8

1076.3±4.3

4.01588.4±4.6

2097.6±4.3

1096.4±5.2

5.015100

20100

（三）ARTP誘變

1、供試菌株：大腸桿菌，

2、誘變條件：功率設(shè)定在100W，氣流量設(shè)定在10slpm，輻照距離2mm。

調(diào)整不同的處理時(shí)間：0s、30s、60s、120s、180s、240s、300s

3、實(shí)驗(yàn)步驟

用移液槍吸取10ul對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌液滴到無(wú)菌的小鐵片中央，再將鐵片

置于帶蓋的無(wú)菌平皿中，每次用無(wú)菌鑷子取一片滴有誘變材料的鐵片置于常壓室

溫等離子體下照射一定時(shí)間，每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)。取相同的菌液作為陰性對(duì)照，

4

陰性對(duì)照不照射等離子體。照射結(jié)束后，立即把照射過(guò)的小鐵片和陰性對(duì)照鐵片

直接放入準(zhǔn)備好的預(yù)先加入1ml培養(yǎng)基的無(wú)菌EP管中，利用旋渦混合器，使菌

株掉落到培養(yǎng)基中。這一過(guò)程相當(dāng)于菌液已經(jīng)被稀釋100倍了。處理完成后的材

料和陰性對(duì)照稀釋到104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml（以誘變材料濃度為初始

值計(jì)算稀釋倍數(shù)），吸取50～100μl涂布固體平板，培養(yǎng)至產(chǎn)生菌落，選擇每塊

平板菌落數(shù)為102cfu數(shù)量級(jí)的平板計(jì)算菌落數(shù)，計(jì)算致死率。

圖2ARTP誘變操作流程圖

制備菌懸液（或孢子懸液）→制作菌物載片→ARTP處理→洗脫形成新的菌懸液→涂布

→培養(yǎng)形成單菌落→液體培養(yǎng)篩選突變株

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，大腸桿菌用ARTP照射300s致死率為100%，240s致死率為

99.3%，可以選擇240s可作為適宜的誘變劑量。

表2大腸桿菌ARTP誘變致死率隨照射時(shí)間的變化

照射時(shí)間（秒）菌落數(shù)（×108）致死率（%）

08500.0

30