GB-T微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定 umu法征求意見稿

ICS07.080

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度檢測(cè)

FACS-umu測(cè)試法

QuantificationofmicrobialDNAdamagecausedbymutagenesis

FACS-umu-test

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

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GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定umu法

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物誘變育種致遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度測(cè)定umu法的原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、

測(cè)定步驟和結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于物理誘變?cè)春突瘜W(xué)誘變?cè)丛斐傻奈⑸镞z傳物質(zhì)損傷測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

YY/T0588流式細(xì)胞儀

3術(shù)語(yǔ)與定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

誘變mutagenesis

通過(guò)人為的措施誘導(dǎo)遺傳基因產(chǎn)生變異的過(guò)程。

注：常用的誘變方法包括物理誘變和化學(xué)誘變等。

3.2

遺傳物質(zhì)損傷DNAdamage

化學(xué)或物理誘變?cè)磳?duì)遺傳物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變。

3.2

遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度DNAdamagestrength

當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷時(shí)會(huì)發(fā)生應(yīng)急修復(fù)（SOS修復(fù)），使其以突變?yōu)榇鷥r(jià)繼續(xù)存活下去。

4原理

在DNA發(fā)生損傷時(shí)，細(xì)菌通過(guò)lexA和recA的共同作用，引起體內(nèi)的SOS響應(yīng)。DNA損傷程度

越高，SOS響應(yīng)越強(qiáng)。通過(guò)將SOS系統(tǒng)調(diào)控基因與指示基因相融合，檢測(cè)指示基因編碼蛋白活性或信

號(hào)強(qiáng)度，即可得到SOS基因的表達(dá)強(qiáng)度，表征DNA損傷強(qiáng)度和環(huán)境致癌物質(zhì)濃度。在umu測(cè)試中，

將編碼DNA聚合酶V中重要組分的umuC基因與編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因融合，導(dǎo)入到Salmonella

typhimurium中，通過(guò)顯色法檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性來(lái)測(cè)定SOS誘導(dǎo)強(qiáng)度。然而，由于誘變過(guò)程會(huì)造成

細(xì)胞的死亡，死細(xì)胞會(huì)對(duì)測(cè)試誘變損傷能力的評(píng)估造成影響。為排除這一影響，F(xiàn)ACS-umu測(cè)試方法利

用流式細(xì)胞分選技術(shù)測(cè)定活細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷強(qiáng)度，其測(cè)試原理為：熒光素-2-β-D-半乳糖苷（FDG）

本身不具有熒光，其被β-半乳糖苷酶水解后的產(chǎn)物熒光素具有熒光。碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）

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是一種DNA熒光染料，只能進(jìn)入失去細(xì)胞膜選擇通透性的細(xì)胞，即死細(xì)胞中，因此可以用于區(qū)分活死

細(xì)胞。采用FDG作為β-半乳糖苷酶的熒光底物，利用PI作為死細(xì)胞染料，通過(guò)采用流式細(xì)胞儀測(cè)定誘

變后活細(xì)胞的β-半乳糖苷酶活性，從而得到活細(xì)胞的DNA損傷強(qiáng)度。

5試劑或材料

除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?/p>

5.1水：GB/T6682二級(jí)。

5.2菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium），包含表達(dá)umuC’-’lacZ基因和氨芐青霉素

抗性基因的pSK1002質(zhì)粒。

5.3TGA培養(yǎng)基

稱取胰蛋白胨10g，氯化鈉5g，HEPES11.9g，加入980ml水溶解，pH調(diào)整為7.0±0.2，定溶

到1000ml。121℃，15min高壓滅菌。溶解2g葡萄糖在20ml去離子水中單獨(dú)滅菌。滅菌后按等比例混合

兩個(gè)溶液，無(wú)菌條件下每升冷卻的TGA培養(yǎng)基中加入50mg氨芐青霉素。改溶液可以在-20℃保存4周。

5.410×TGA培養(yǎng)基

包含10倍濃度的TGA溶液，可以在4℃保存14天。

5.5熒光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷（Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside，F(xiàn)DG）溶液

在10ml含體積比為1%DMSO和1%乙醇的水中溶解13.13mgFDG，F(xiàn)DG終濃度為2mM，分裝后保存在-20℃

冰箱中。使用前在37℃預(yù)熱15min以上。

5.6碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）溶液

在10mlPBS溶液中溶解6.68mgPI，配成濃度為1mM的PI溶液。用移液槍吸取10ul濃度為1mM的PI

儲(chǔ)備液，溶于10mlPBS溶液中，配成濃度1uM的PI溶液，作為PI工作液。于4℃保存，使用前在冰上放

置預(yù)冷。

6儀器設(shè)備

6.1恒溫水浴鍋（37±1）℃；

6.2pH計(jì)；0.1；

6.3電子天平；0.01；

6.4高速離心機(jī)；

6.5流式細(xì)胞儀；

6.6恒溫震蕩搖床，溫度可實(shí)現(xiàn)（28±1）℃和（37±1）℃，轉(zhuǎn)速在125r/min到150r/min；

7測(cè)定步驟

7.1測(cè)試菌過(guò)夜培養(yǎng)物制備

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GB/T××××—201×

在三角瓶中裝入20mlTGA培養(yǎng)基用透氣無(wú)菌瓶塞封口，滅菌儲(chǔ)存；融化凍存的測(cè)試菌，在凍存管

中加入1mlTGA培養(yǎng)基，3000g離心凍存管中的測(cè)試菌10min，丟棄上清液，用1mLTGA培養(yǎng)基重懸測(cè)

試菌，用0.5ml測(cè)試菌重懸液接種到含TGA培養(yǎng)基的三角瓶中，在（37±1）℃搖動(dòng)培養(yǎng)過(guò)夜（不超過(guò)12

h）。

7.2誘變測(cè)試微生物樣品制備

用新鮮的TGA培養(yǎng)基（37℃）將過(guò)夜培養(yǎng)的測(cè)試菌稀釋10倍。繼續(xù)在37±1）℃搖動(dòng)培養(yǎng)1.5天。在

（600±20）nm用1cm比色皿檢測(cè)光密度，以TGA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，誘變測(cè)試微生物樣品應(yīng)處于對(duì)數(shù)

生長(zhǎng)期。

7.3誘變

7.3.1化學(xué)誘變

根據(jù)測(cè)試需求，宜通過(guò)文獻(xiàn)等資料或設(shè)置預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定化學(xué)誘變劑的種類和濃度。

將10ul不同濃度的化學(xué)誘變劑加入到1ml誘變樣品（9.2）中，置于1.5ml的EP管，在37±1℃，200

r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。對(duì)照為在1mlTGA培養(yǎng)基中加入10ulDMSO。

7.3.2物理誘變

根據(jù)測(cè)試需求，宜通過(guò)文獻(xiàn)等資料或設(shè)置預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定物理誘變條件。

取100ul接種物（9.2）進(jìn)行物理誘變處理，對(duì)照為沒(méi)有進(jìn)行物理誘變處理的樣品。處理后的樣品

和對(duì)照轉(zhuǎn)移到1.5mlEP管中，在37±1℃，200r/min震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。

7.4FDG和PI染色

取化學(xué)或物理誘變后的測(cè)試樣品50l置于1.5ml的EP管中，在37℃預(yù)熱5min，加入37℃預(yù)熱的

FDG溶液50ul，迅速溫和混勻后，置于37℃水浴中2min，使FDG滲透進(jìn)入細(xì)胞。之后迅速加入500l

的PI溶液，將混合液放置于冰上反應(yīng)1h，在進(jìn)行流式細(xì)胞測(cè)定前一直置于冰上。

7.5流式細(xì)胞儀測(cè)定

使用流式細(xì)胞儀對(duì)染色后樣品進(jìn)行流式分析。采用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm，對(duì)于FDG水解產(chǎn)物熒光素的

熒光強(qiáng)度測(cè)定接收波長(zhǎng)為525±30nm（FL-1通道），PI染色熒光測(cè)定接收波長(zhǎng)為670nm（FL-2通道）。

測(cè)定細(xì)胞總數(shù)為5000到10000個(gè)細(xì)胞。

8結(jié)果分析

8.1閾值設(shè)定

通過(guò)前向角散射光FSC和側(cè)向角散射光SSC圈出目標(biāo)菌體，以去除多細(xì)胞粘連對(duì)結(jié)果的影響。通過(guò)

單獨(dú)的PI染色，測(cè)定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-1通道熒光值作為背景值，即為FDG染色陰性

細(xì)胞。通過(guò)單獨(dú)的FDG染色，測(cè)定FL-1通道和FL-2通道的熒光值，其FL-2通道熒光值作為背景值，即為

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PI染色陰性細(xì)胞。對(duì)于FDG和PI同時(shí)染色的樣品，選取FDG染色和PI染色陽(yáng)性為目標(biāo)細(xì)胞群，用于后續(xù)

數(shù)據(jù)處理。

8.2結(jié)果計(jì)算

按照式（1）進(jìn)行計(jì)算：