GB-T微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定 浸蟲法征求意見稿草案

ICSXXXX

A21

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/TXXXXX—201X

微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線

蟲活性測(cè)定浸蟲法

Determinationofnematicidalactivityformicrobialsecondary

metabolites——Immersionmethod

（征求意見稿）

201X-XX-XX發(fā)布201X-XX-XX實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1化管理委員會(huì)

GB/T××××—201×

GB/T××××—201×

次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性測(cè)定的原理、儀器設(shè)備、試劑與材料、

操作步驟、結(jié)果分析。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物殺線蟲活性的測(cè)定。

2術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

2.1

致死中濃度lethalconcentration50%，LC50

LC50指的是使受試線蟲半數(shù)死亡的次生代謝產(chǎn)物的濃度。

3原理

將線蟲浸入微生物源抗生素類次生代謝產(chǎn)物藥劑中使線蟲死亡，用中性紅將線蟲死細(xì)胞或組織染成

在顯微鏡下可見的紅色，通過(guò)染色情況判斷次生代謝產(chǎn)物對(duì)線蟲的致死情況，計(jì)算線蟲的校正死亡率，

根據(jù)校正死亡率的幾率值和藥劑濃度對(duì)數(shù)的線性回歸關(guān)系得到回歸曲線，計(jì)算得到LC50，從而測(cè)定次

生代謝產(chǎn)物殺線蟲的活性。

4儀器設(shè)備

4.1恒溫培養(yǎng)箱：溫度偏差在±1℃以內(nèi)。

4.2顯微鏡：最小放大倍數(shù)為10倍。

4.3電子天平：稱量精度0.1g以上。

4.4微量移液器。

4.5離心機(jī)。

4.6計(jì)數(shù)器。

5試劑與材料

所有試劑除另有說(shuō)明外，均為分析純，水為符合GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。

5.15mg/mL膽固醇溶液

稱取適量膽固醇，溶于相應(yīng)體積的無(wú)水乙醇中，配成5mg/mL的膽固醇溶液，0.22μm孔徑的濾

膜過(guò)濾除菌。

5.21mol/L氯化鈣溶液

稱取適量膽固醇，溶于相應(yīng)體積的去離子水中，配成1mol/L的氯化鈣溶液，0.22μm孔徑的濾膜

過(guò)濾除菌。

5.31mol/L硫酸鎂溶液

稱取適量七水硫酸鎂，溶于相應(yīng)體積的去離子水中，配成1mol/L的氯化鈣溶液，0.22μm孔徑的

濾膜過(guò)濾除菌。

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5.41mol/L磷酸緩沖液，pH6.0

稱取118.1g磷酸二氫鉀，23.0g磷酸氫二鉀，溶解于900mL的去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至6.0，

再加去離子水定容到1L，0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌。

5.5線蟲專用緩沖液（M9緩沖液）

取3.0g磷酸二氫鉀，6.0g磷酸氫二鈉，5.0g氯化鈉，1mL濃度為1mol/L的七水硫酸鎂，用去

離子水溶解，并定容到1L，0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾除菌。

5.6次氯酸鈉裂解液

取0.1g氫氧化鈉，溶于3.5mL去離子水中，再加入1mL含活氯10-15%的次氯酸鈉溶液混合。

5.7瓊脂培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）

稱取10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0g氯化鈉，去離子水定容到1L，121℃滅菌20min。

5.8線蟲生長(zhǎng)固體培養(yǎng)基（nematodegrowthmedia，NGM）

稱取2.5g胰蛋白胨，3.0g氯化鈉，17.0g瓊脂粉，用去離子水溶解并定容到975mL，121℃滅菌

20min，冷卻到55℃左右時(shí)，加入1mL濃度為5mg/mL的膽固醇溶液，1mL濃度為1mol/L的氯化

鈣溶液，1mL濃度為1mol/L的硫酸鎂溶液，25mL濃度為1mol/LpH6.0的磷酸鉀緩沖液。

5.90.1%（w/v）中性紅溶液

稱取適量中性紅粉末溶于相應(yīng)體積的生理鹽水中，配成0.1%的中性紅溶液，0.22μm孔徑的濾膜

過(guò)濾。

5.10N2野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans，theBristolstrainN2）

5.11尿嘧啶缺陷型大腸桿菌（EscherichiacoliOP50）

6操作步驟

6.1大腸桿菌OP50的培養(yǎng)與接種

挑取大腸桿菌OP50單菌落于LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取0.1mL菌液涂布于NGM固

體培養(yǎng)基上，室溫放置約30min。

6.2N2野生型秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與同步化

將N2野生型秀麗隱桿線蟲接入含有大腸桿菌OP50的NGM固體培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)3天，用

M9緩沖液沖洗NMG固體培養(yǎng)基上，收集處于產(chǎn)卵期的線蟲。用移液器吸取1mL含產(chǎn)卵期線蟲的M9

緩沖液至10mL的離心管中，向管中加入4.5mL次氯酸鈉裂解液，上下顛倒混合約3-5分鐘，約800g

的轉(zhuǎn)速離心2分鐘，棄上清收集蟲卵，用M9緩沖液重復(fù)洗滌和離心3次后，用0.2mL無(wú)菌M9緩沖

液懸浮蟲卵，將卵液轉(zhuǎn)移到含大腸桿菌OP50的NMG固體培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)48h，線蟲成長(zhǎng)至

四齡幼蟲。

6.3藥劑活性測(cè)定

6.3.1藥劑配制

水溶性藥劑直接用水溶解，非水溶性藥劑用二甲基亞砜溶解。在0.001~10mg/mL濃度范圍內(nèi)按照

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等比或等差的方法設(shè)置5以上個(gè)系列質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度藥液量不少于10mL。

6.3.2試蟲準(zhǔn)備

用無(wú)菌M9緩沖液將6.2中的四齡線蟲從NGM固體培養(yǎng)基上沖洗下來(lái)，800g轉(zhuǎn)錄離心2分鐘，棄

上清液，棄上清收集蟲體，用M9緩沖液重復(fù)洗滌和離心2次，最后用無(wú)菌M9緩沖液重懸線蟲至濃度

80-100頭/mL，備用。

6.3.3藥劑處理

用移液器分別吸取6.3.1中不同濃度的藥劑溶液和清水對(duì)照各2mL，加入到不同的5mL試管中，

每個(gè)試管另加入大腸桿菌OP50的M9緩沖液懸液1mL，將6.3.2的線蟲懸液1mL加入到上述試管中，

將試管置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。每個(gè)濃度的藥劑和清水處理各設(shè)置3次重復(fù)。

6.3.4線蟲染色與死亡線蟲記錄

6.3.3藥劑處理后，將試管置于離心機(jī)中，800g離心5分鐘，棄上清收集蟲體，用M9緩沖液重復(fù)

洗滌和離心2次。加入100μL的0.1%中性紅溶液進(jìn)行染色，染色5min后，800g離心5min，棄上

清，加入M9緩沖液100μL懸浮線蟲，并轉(zhuǎn)移至96孔板中。半身以上染為紅色的線蟲判定為死亡線

蟲。在顯微鏡下觀察線蟲死亡情況，記錄每個(gè)濃度藥劑處理后觀察到的線蟲總數(shù)和死亡線蟲數(shù)。每個(gè)處

理的重復(fù)試驗(yàn)，觀察的線蟲不少于30頭。

7結(jié)果分析

7.1結(jié)果計(jì)算

死亡率和校正死亡率分別按公式（1）和（2）計(jì)算：

……………………(1)

?

1

式?中=：?×100

P1——死亡率（%）；

K——死亡線蟲數(shù)（頭）；

N——觀察總線蟲數(shù)（頭）。

……………………(2)

?1??0

20

式?中=：1??×100

P2——校正死亡率（%）

P1——處理線蟲死亡率（%）

P0——對(duì)照線蟲死亡率（%）

若對(duì)照死亡率小于5%，無(wú)需校正；若對(duì)照死亡率在5~15%之間，應(yīng)按照公式（2）進(jìn)行校正；對(duì)

照死亡率大于15%，試驗(yàn)需要重做。

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根據(jù)藥劑濃度對(duì)數(shù)值與對(duì)應(yīng)校正死亡率的幾率值作回歸分析，計(jì)算回歸曲線的R2值。選擇R2值在

0.95以上且最高的5個(gè)以上連續(xù)梯度的藥劑濃度來(lái)得到最終的回歸曲線Y=aX+b，其中Y為校正死

亡率的幾率值，X為濃度對(duì)數(shù)值，a為回歸曲線斜率，b