浙江大學(xué)沃森研究院 實(shí)習(xí)3芯片的基本數(shù)據(jù)處理和分析

實(shí)習(xí)三

芯片的基本數(shù)據(jù)處理和分析

阮陟馮曄陳歡樓小燕

實(shí)習(xí)一基因組數(shù)據(jù)注釋和功能分析實(shí)習(xí)二核苷酸序列分析實(shí)習(xí)三芯片的基本數(shù)據(jù)處理和分析實(shí)習(xí)四蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析實(shí)習(xí)五蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析實(shí)習(xí)六系統(tǒng)生物學(xué)軟件實(shí)習(xí)課程內(nèi)容基因組學(xué)轉(zhuǎn)錄物組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)習(xí)內(nèi)容：TIGRTM4軟件的介紹和使用GenMAPP軟件的介紹和使用GEO數(shù)據(jù)庫的介紹芯片數(shù)據(jù)分析的一般流程：芯片雜交實(shí)驗(yàn)，芯片數(shù)據(jù)采集（讀取掃描圖）數(shù)據(jù)基本處理數(shù)據(jù)提交公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

ApackageofOpenSourcesoftwareprogramsforMicroarrayanalysis

芯片數(shù)據(jù)采集（讀取掃描圖）數(shù)據(jù)基本處理存儲整理芯片數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)庫）芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果的圖形顯示（

/）TIGRTM4:Cy3Cy5Cy5-cDNACy3-cDNARTRTcDNAarray樣本mRNA對照mRNATIF掃描圖常見的雙通道（dualchannel）實(shí)驗(yàn)流程：對照基因(referencegene)：綠色熒光標(biāo)記(G)樣本基因(samplegene)：紅色熒光標(biāo)記(R)什么是區(qū)塊（block）？非飽和區(qū)域飽和區(qū)域信號雜交的一些概念背景探針區(qū)域MEV文件：MEV格式的芯片數(shù)據(jù)UID: Uniqueidentifierforthisspot.IA: Integratedintensityforchannel1(Cy3).IB: Integratedintensityforchannel2(Cy5).R: Row(slide_row).C: Column(slidecolumn).MR: Meta-row(blockrow).MC: Meta-column(blockcolumn).SR: Sub-row(rowinblock).SC: Sub-column(columninblock).FlagA: TIGRSpotFinderflagvalueforchannel1.FlagB: TIGRSpotFinderflagvalueforchannel2.BkgA: Backgroundintensityforchannel1.BkgB: Backgroundintensityforchannel2.SAA: Spotareaforchannel1.SAB: Spotareaforchannel2.MedA: MedianIntensityforchannel1(Cy3).MedB: MedianIntensityforchannel2(Cy5).位置信號值FlagsinMevfile:A–0non-saturatedpixelsinthespotB–0-50non-saturatedpixelsinthespotC–50ormorenon-saturatedpixelsinthespotX–spotisrejected,duetospotshapeandintensityrelativetobackgroundY–backgroundishigherthanspotintensityZ–spotnotdetectedbySpotfindergoodMEV注釋文件（后綴名為.ann）GenePix格式（.gpr）Agilent格式（.txt）：ExpressConverter:芯片數(shù)據(jù)的格式轉(zhuǎn)換下載地址：/programs/ExprConvt2_0.zip；下載后，解壓安裝即可?！伴_始”－>“所有程序”處打開。需要先安裝Java，Java下載地址：;ExpressConverter主界面：ExpressConverter使用方法：選擇“InputFormat→GenPix”,指定輸入的文件格式;

選擇“File→Selectinputfiles”，選定一個(gè)或多個(gè)需要轉(zhuǎn)換的文件;選擇“File→Startconverting”，格式開始轉(zhuǎn)換。待狀態(tài)欄顯示“Convertingissuccessful”后，格式轉(zhuǎn)換完成。此時(shí)在原genepix存放的文件夾中會出現(xiàn)文件名相同但擴(kuò)展名不同的.mev和.ann的文件。

inputoutput課堂練習(xí)使用ExpressConverter將testdata.gpr轉(zhuǎn)換成testdata.mev和testdata.ann。用記事本查看testdata.gpr，testdata.mev和testdata.ann。ExpressConverter快捷方式：“開始”→“所有程序”testdata.gpr：C:\ProgramFiles\ExpressConverter\samples\MIDAS:數(shù)據(jù)基本處理下載地址是：/midas.html。此程序不用安裝下載后解壓就可以使用。（需要先安裝Java）進(jìn)入文件夾，雙擊打開Midas.bat文件，會出現(xiàn)后臺運(yùn)行窗口和圖形界面窗口。低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾根據(jù)Flag過濾根據(jù)信號和背景值過濾芯片內(nèi)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化（Normalization）AAMAplotInmanymicroarraygeneexpressionexperiments,thegeneralassumptionisthatmostofthegeneswouldnotseeanychangeintheirexpression.Thereforethemajorityofthepointsontheyaxis(M)wouldbelocatedat0,sincelog(1)is0.區(qū)塊間均一化處理MIDAS程序界面MIDAS可選的數(shù)據(jù)處理方法

標(biāo)準(zhǔn)化處理方法TotalIntensitynormalization

低質(zhì)量數(shù)據(jù)過濾方法Invalid-intensitycheckingLOWESS(Locfit)normalizationIterativelinearregressionnormalizationIterativelogmeancenteringnormalizationRatioStatisticsnormalizationLowintensityfilterStandarddeviationregularizationSliceanalysis(non-statistical)In-slidereplicatesanalysisFlip-dyeconsistencycheckingRatioStatisticsconfidenceintervalcheckingSignal/NoisecheckingCross-file-trimSpotQCflagcheckingMA-ANOVACross-slidereplicatest-test(statistical)Cross-slideone-classSAM(statistical)

差異表達(dá)基因識別方法用MIDAS處理單張雙色芯片的基本流程芯片數(shù)據(jù)的讀入；低質(zhì)量數(shù)據(jù)的過濾；標(biāo)準(zhǔn)化（包括區(qū)塊間的均一化）；結(jié)果文件的輸出。Step1：芯片數(shù)據(jù)的讀入Step2：低質(zhì)量數(shù)據(jù)的過濾Step3：標(biāo)準(zhǔn)化（包括區(qū)塊間的均一化）Step4：結(jié)果文件的輸出結(jié)果文件（夾）*_MDS.mevRawLow_intensity_filterLowessSd_regMIDAS統(tǒng)計(jì)作圖（MIDASInvestigation窗口查看）R-Iplot(.prc)Boxplot(.box)FlipDyeDiagnosticplot(.rrc)Intensityplot(.ity,.lty)Z-scoreDistributionplot(.his)SAMplot(.sam)課堂練習(xí)使用MIDAS處理testdata.mev，并查看結(jié)果文件；MIDAS程序位置：C:\zcni\shiyan3\MIDAS2_19，雙擊Midas.bat打開程序；輸入文件testdata.mev由ExpressConverter產(chǎn)生，在C:\ProgramFiles\ExpressConverter\example\。多樣本芯片實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)適用范圍：分型，不同發(fā)育階段的表達(dá)，不同劑量藥物下的表達(dá)等；使用共同的對照：采用標(biāo)準(zhǔn)對照，或?qū)⑺袠悠坊旌献鳛楣餐瑢φ?。多樣本?shí)驗(yàn)的兩種常用分析聚類分析差異表達(dá)基因的篩選下載地址：/mev.html

。此程序不用安裝下載后解壓就可以使用（需要先安裝Java）進(jìn)入軟件所在的文件夾（免安裝），雙擊打開TMEV.bat文件，會出現(xiàn)后臺運(yùn)行窗口和圖形界面窗口。MeV4.3程序主界面常用工具欄導(dǎo)航欄結(jié)果界面MeV4.3支持的文件格式MIDASMEV,TAV格式表格格式GEO格式Affymetrix格式GPR格式Agilent格式專題一表格格式數(shù)據(jù)的讀入與轉(zhuǎn)化專題二系統(tǒng)聚類法對基因和樣本聚類專題三使用SAM查找差異表達(dá)基因?qū)ｎ}一表格格式數(shù)據(jù)的讀入與轉(zhuǎn)化①選擇“File→LoadData”彈出導(dǎo)入數(shù)據(jù)對話框②③④⑤⑥數(shù)據(jù)起始位置不同顏色表示相對表達(dá)量樣本名基因名Heatmap

View專題二系統(tǒng)聚類法對基因和樣本聚類①②聚類分析結(jié)果圖：存儲和注釋感興趣的分類：①單擊鼠標(biāo)左鍵選中目標(biāo)分類使其高亮化；②右鍵選擇菜單中的StoreCluster，并設(shè)置注釋的名稱和顏色等信息。專題三使用SAM查找差異表達(dá)基因①不同實(shí)驗(yàn)類型樣本分組②③④⑤Sam結(jié)果：ExpressionImagesSam結(jié)果：CentroidGraphsSam結(jié)果：ExpressionGraphsSam結(jié)果：TableViews如何進(jìn)一步學(xué)習(xí)使用MeV①在使用軟件的過程中隨時(shí)查閱即時(shí)幫助②查閱軟件的使用手冊(Manual)③前往TM4主頁查閱最新信息和軟件更新課堂練習(xí)使用MeV處理TDMS_format_sample.txt

，并查看結(jié)果文件；MEV程序位置：C:\zcni\shiyan3\MeV_4_3，雙擊TMEV.bat打開程序；輸入文件TDMS_format_sample.txt位于：C:\zcni\shiyan3\MeV_4_3\data\。GenMAPP

一款將芯片數(shù)據(jù)和代謝途徑結(jié)合起來的圖形化顯示工具下載地址：/download.asp；雙擊安裝文件安裝GenMAPP；打開GenMAPP程序，從菜單“Data→DownloadDatafromGenMAPP.org”下載自己感興趣物種的MAPP文件和GeneDatabase。

GenMAPP安裝和更新GenMAPP基本概念MAPP：描述了模式生物的代謝途徑圖。目前MAPP數(shù)據(jù)庫中包含了人(H.sapiens)、小鼠(M.musculus)、大鼠(R.norvegicus)、酵母(S.cerevisiae)、線蟲(C.elegans)、狗(C.familiaris)、雞(G.gallus)、牛(B.taurus)、果蠅(D.melanogaster)和斑馬魚(D.rerio)等模式生物。

Genedatabase：包含了上述物種所含基因的注釋及其基因標(biāo)識號（ID）。對于每個(gè)基因，GeneDatabase會建立它在各個(gè)geneIDsystem中的對應(yīng)關(guān)系。比如，Trp53基因在MGI（小鼠基因組數(shù)據(jù)庫）中的標(biāo)識號為MGI:98834，而在UniGene數(shù)據(jù)庫中標(biāo)識號為Mm.222，在Ensembl數(shù)據(jù)庫中標(biāo)識號為ENSMUSG00000059552。IDSystem(Species)SystemCodeAffymetrixProbeSetIDXPDBPdEMBLEmPfamPfEnsemblEnRefSeqQEntrezGeneLRGD(R.norvegicus)RFlyBase(D.melanogaster)FSGD(S.cerevisiae)DGeneOntologyTUniProt/TrEMBLSHUGOHUniGeneUInterProIWormBase(C.elegans)WMGI(M.musculus)MZFIN(D.rerio)ZOMIMOmOtherOStep1：打開“GenMAPP2”程序。選擇菜單“Data→ChooseGeneDatabase”按照實(shí)驗(yàn)物種選擇合適的基因庫。Step2：從菜單“File→Open”打開自己感興趣的MAPP文件。Step3：從菜單“Data→ChooseExpressionDataset”打開表達(dá)量文件（.gex）并選擇相應(yīng)的顏色集。Step4:點(diǎn)擊感興趣的基因查看注釋如何制作.gex表達(dá)量文件？將芯片數(shù)據(jù)用Excel中按一定格式整理2.將Excel另存為文本文件（txt后綴名或csv后綴名），可在Data菜單“ExpressionDatasets→Newdataset”導(dǎo)入該文本文件。此時(shí)，程序會向用戶提問文件中的數(shù)據(jù)是數(shù)值型還是文本型，對文本文件要在圖示框中選勾，點(diǎn)擊“OK”即可，一般ControlAverage、TreatedAverage、FoldChange和p-value為數(shù)值型，其他為文本型。

如何制作顏色集（colorset）？在菜單“Data→ExpressionDatasetManager”界面下從菜單“Colorsets→new”新定義一個(gè)顏色集。

課堂練習(xí)在“開始”→“所有程序”處打開GenMAPP2程序；GeneDatabase文件位置：

C:\GenMAPP2Data\GeneDatabases\；MAPP文件位置：C:\GenMAPP2Data\MAPPs\；芯片表達(dá)量文件位置：

C:\GenMAPP2Data\ExpressionDatasets\；芯片數(shù)據(jù)的檢索和提交常用的芯片數(shù)據(jù)庫NCBIGEO:

/geo/EBIArrayExpress:http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/aer/?#ae-main[0]

StanfordMicroarrayDatabase:/UCSCMicroarrayDatabase:/research/research_microarraydata.shtmlGEO(GeneExpressionOmnibus)主頁檢索入口提交入口也可這樣檢索：

NCBI主頁

Search“GEODatasets”以檢索人類癌癥相關(guān)的芯片實(shí)驗(yàn)為例，輸入“humanANDcancer”：每條記錄包含的信息：Platform: 芯片信息Sample:樣本信息Series:系列信息Platform信息：Platform_title：芯片名稱；Platform_technology：點(diǎn)制芯片探針的方法，例如ORF或cDNA的PCR產(chǎn)物（spottedDNA/cDNA）、原位雜交的寡核苷酸（insituoligonucleotide）和直接點(diǎn)樣的寡核苷酸（spottedoligonucleotide）等；Platform_distribution：注明是否屬于商品芯片（non-commercial,commercial,custom-commercial）；Platform_organism：芯片適用的物種；Platform_manufacturer：芯片制作單位；Platform_manufacture_protocol：芯片制作的實(shí)驗(yàn)過程，例如探針合成方式和點(diǎn)樣方式等；platform_table：芯片中每一個(gè)點(diǎn)的探針的內(nèi)容。Sample信息：Sample_title：樣本名稱；Sample_supplementary_file：樣本附件的名稱。附件指的是芯片雜交后掃描的TIFF格式的圖像等文件。Sample_source_name_ch1：channel1樣本DNA/RNA材料的來源（來源于哪個(gè)組織，細(xì)胞等等）；Sample_organism_ch1：channel1樣本DNA/RNA材料來源于哪個(gè)物種；Sample_characteristics_ch1：channel1樣本DNA/RNA材料的特點(diǎn)；Sample_molecule_ch1：channel1樣本分子的特性（totalRNA,polyARNA,cytoplasmicRNA,nuclearRNA,genomicDNA,等等）；Sample_extract_protocol_ch1：channel1樣本提取的步驟；Sample_label_ch1：channel1樣本標(biāo)記的染料（Cy3orCy5）；Sample_label_protocol_ch1：channel1樣本標(biāo)記染料的步驟；Sample_source_name_ch2，Sample_organism_ch2，Sample_characteristics_ch2，Sample_gro