第一講基因工程

第一講基因工程選修3現(xiàn)代生物科技專題考點(diǎn)一基因工程的操作工具

基因工程，通俗地說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳性狀?；蚬こ痰母拍罨蚬こ痰膭e名操作環(huán)境原理基本過程優(yōu)勢目的DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)生物體外基因重組人類需要的生物類型和生物產(chǎn)品定向改造性狀、打破物種界限剪切→拼接→導(dǎo)入→檢測表達(dá)

DNA重組技術(shù)的基本工具“分子手術(shù)刀”--“分子縫合針”--“分子運(yùn)輸車”--限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶載體

DNA重組技術(shù)的基本工具識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)。1、來源：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平末端可用于目的基因和載體的切割2、特性：限制酶是一類酶，而不是一種酶。一、限制酶——“分子手術(shù)刀”AT磷酸二酯鍵1234512345

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。平末端

平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。例1.下列有關(guān)基因工程中限制性內(nèi)切酶的描述，錯誤的是(

)

A．一種限制性內(nèi)切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列

B．限制性內(nèi)切酶的活性受溫度影響

C．限制性內(nèi)切酶能識別和切割RNA

D．限制性內(nèi)切酶可從原核生物中提取C1、種類：2、作用部位：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶磷酸二酯鍵

二、DNA連接酶——“分子縫合針”（黏性末端）（黏性末端和平末端）兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象

作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個(gè)脫氧核苷酸加到已存在的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵1．下圖為DNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是 (

)

A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②C與DNA有關(guān)的酶種類項(xiàng)目限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脫氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對間的氫鍵作用結(jié)果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子三、載體——“分子運(yùn)輸車”1、載體的作用將

轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。目的基因2、常用的載體

質(zhì)粒、λ噬菌體的衍生物、動植物病毒3、作為載體必須具備的條件①能在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定保存并大量復(fù)制；

②有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn),以便于與外源基因連接；

③有特殊的遺傳標(biāo)記基因,供重組DNA的檢測和鑒定有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)?！懵兜?、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體——質(zhì)粒典例1.下列關(guān)于染色體和質(zhì)粒的敘述，正確的是()A．染色體和質(zhì)粒的化學(xué)本質(zhì)都是DNAB．染色體和質(zhì)粒都只存在于原核細(xì)胞中C．染色體和質(zhì)粒都與生物的遺傳有關(guān)D．染色體和質(zhì)粒都可作為基因工程的常用載體C能自我復(fù)制、具有標(biāo)記基因(答出兩點(diǎn)即可)二者均不含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均不生長含有質(zhì)粒載體含有重組質(zhì)粒二者均含有氨芐青霉素抗性基因，在該培養(yǎng)基上均能生長四環(huán)素受體細(xì)胞

二、基因工程的基本操作程序編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達(dá)（調(diào)控程序）…A‥………ATGTGCACGTAGTTA………‥G……T‥………TACACGTGCATCAAT………‥C…啟動子終止子一：基因的結(jié)構(gòu)1.原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子ATGTGCACGTAGTTATACACGTGCATCAATRNA聚合酶AUGUGCACGUAGUUA

啟動子：位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì).

終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子外顯子內(nèi)含子編碼蛋白質(zhì)2.真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的3.原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼二：基因工程基本操作的四個(gè)步驟1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測與鑒定1、目的基因主要是______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法：（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成一、目的基因的獲?。ㄒ唬幕蛭膸熘蝎@取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）（一）從基因文庫中獲取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫1.基因文庫的構(gòu)建方法（1）直接分離法(鳥槍法)某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（2）反轉(zhuǎn)錄法基因組DNA文庫cDNA文庫2.基因組DNA文庫與cDNA文庫比較2.基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內(nèi)含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以①概念：PCR全稱為_______________，是一項(xiàng)在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)。③前提條件：_______________________；原料：___________、___________、__________________、________________。②原理：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶模板DNA（二）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因④過程：a、變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、復(fù)性（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因?yàn)槟０?，合成互補(bǔ)的新DNA鏈變性退火延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成已知核苷酸序列的較小基因可以化學(xué)合成，不需要模板。（三）人工合成獲取目的基因人工合成(基因序列已知，且比較小)DNA合成儀質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種1.基因表達(dá)載體的構(gòu)建二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心限制酶切割位點(diǎn)的選擇必須保證目的基因，標(biāo)記基因的完整性，以便于檢測和表達(dá)。2.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因位于基因的首端,RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)位于基因的末端,終止轉(zhuǎn)錄檢測目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：與載體相比較,表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵

啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(RNA);

終止子(DNA片段)≠終止密碼子(RNA)提醒：三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞法目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①特點(diǎn)：

易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力②原理：

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物（3）花粉管通道法適用于被子植物①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵

新性狀動物2、將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①原核生物特點(diǎn)：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞思考：為什么要用Ca2+處理受體細(xì)胞？用Ca2＋處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性四、目的基因的檢測與鑒定檢測①導(dǎo)入檢測：目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞方法——DNA分子雜交②表達(dá)檢測轉(zhuǎn)錄檢測——分子雜交翻譯檢測——抗原抗體雜交分子檢測法鑒定抗蟲鑒定抗病鑒定活性鑒定等個(gè)體水平的鑒定DNA分子雜交15N15N14N14N探針轉(zhuǎn)基因生物的DNA變性變性①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；②將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：過程逆轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法從部分基因文庫，如cDNA文庫中獲取從基因組文庫中獲取人工合成從基因文庫中獲取方法編碼乙的DNA序列起始端無ATG(TAC)，轉(zhuǎn)錄出的mRNA無起始密碼子模板dNTP(脫氧核苷酸)

三、基因工程的應(yīng)用抗病

抗逆

生長速度品質(zhì)藥物器官移植

將

基因與

等調(diào)控組件重組在一起，通過

等方法，導(dǎo)入哺乳動物的

中，將其送入母體，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)入泌乳期后，可以通過分泌乳汁生產(chǎn)所需要的藥品，稱為乳腺生物反應(yīng)器或乳房生物反應(yīng)器。乳腺生物反應(yīng)器乳腺生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)：①產(chǎn)量高；②質(zhì)量好；③成本低；④易提取。

藥物蛋白乳腺蛋白基因的啟動子顯微注射受精卵1、基因治療概念：基因治療

把正?；?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的，是治療遺傳病的最有效的手段。（把特定的外源基因?qū)胗谢蛉毕莸募?xì)胞中，從而達(dá)到治療疾病的目的）2、實(shí)例：

將腺苷酸脫氨酶基因轉(zhuǎn)入取自患者的淋巴細(xì)胞中，再將這種淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)入患者體內(nèi)。對嚴(yán)重復(fù)合型免疫缺陷癥的治療3、原理病人細(xì)胞中既含有缺陷基因，又含有通過基因工程導(dǎo)入的正?；?，在病人體內(nèi)兩種基因都存在且都能表達(dá)，正常基因的表達(dá)產(chǎn)物掩蓋了缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物，從而治愈了有基因缺陷的疾病。4、基因治療的類型體外基因治療：先從病人體內(nèi)獲得某種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)，最后重新輸入患者體內(nèi)。體內(nèi)基因治療：直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移的治病方法。（如將治療囊性纖維病的正?；蜣D(zhuǎn)入患者肺組織）5、基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀：處于初期的臨床試驗(yàn)階段基因診斷概念用放射性同位素或熒光分子等標(biāo)記的DNA分子做探針，利用DNA分子雜交原理，鑒定被測標(biāo)本上的遺傳信息，達(dá)到檢測疾病的目的。四、蛋白質(zhì)工程的崛起

一、蛋白質(zhì)工程的崛起的緣由基因工程產(chǎn)物基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)。這些天然蛋白質(zhì)是生物在長期進(jìn)化過程中形成的,它們的結(jié)構(gòu)和功能符合特定物種生存的需要,卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活的需要。二、蛋白質(zhì)工程的基本原理1、蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)

根據(jù)人們對蛋白質(zhì)功能的特定需求，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。2、天然蛋白質(zhì)的合成過程DNA（基因）轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)基因→表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）→形成氨基酸序列的多肽鏈→形成具有高級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)→行使生物功能３、蛋白質(zhì)工程的基本途徑預(yù)期的蛋白質(zhì)功能設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測應(yīng)有的氨基酸序列找到相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）4、蛋白質(zhì)工程的概