七種觀察方式

顯微觀察方式觀察方式1.明場觀察2.暗場觀察(暗視野)3.相差觀察4.偏光觀察5.DIC觀察(微分干預(yù))6.RC觀察(浮雕相襯)7.熒光觀察(一)明場觀察方式常規(guī)觀察方式應(yīng)用領(lǐng)域： 常規(guī)鏡檢、病理、染色標(biāo)本優(yōu)點(diǎn)： 視野亮度高、均勻， 應(yīng)用范圍廣， 操作簡單，價格低， 物鏡適用于熒光觀察缺點(diǎn)： 透明標(biāo)本比照度低， 標(biāo)本沒有立體感(二)暗視野觀察方式1原理丁道爾(Tyndall)現(xiàn)象，微粒對斜射光反射或衍射，增大了人眼可見性。2特點(diǎn)觀察到極其微小物體，分辨率可達(dá)0.02~0.004um(明場0.4um)—”超顯微“。3缺點(diǎn)只能觀察到物體存在、運(yùn)動和外部形態(tài)不方便調(diào)節(jié)標(biāo)本要求高〔灰塵、蓋片、載片〕4應(yīng)用：

微小粒子、細(xì)菌形態(tài)觀察、細(xì)菌記數(shù)，透明標(biāo)本觀察等(二)暗視野觀察方式〔三〕相差觀察方式1原理利用被檢物體的光程〔折射率x厚度〕差進(jìn)行鏡檢，即利用干預(yù)現(xiàn)象，將相位差變?yōu)槿搜劭梢苑直娴恼穹罟曹椕妫何展饩€，直射光通過補(bǔ)償面：相位推遲，衍射光通過物鏡相板聚光鏡環(huán)狀光闌(三)相差觀察方式2特點(diǎn)鑒定活體細(xì)胞最實用、最經(jīng)濟(jì)的方法3缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高切片不能太厚(5~10um)蓋片、載片需符合標(biāo)準(zhǔn)最好配用單色濾光鏡操作較麻煩熒光效果不如明場物鏡(三)相差觀察方式4應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，檢查,鑒定活體細(xì)胞(培養(yǎng)細(xì)胞,別離細(xì)胞)(三)相差觀察方式5調(diào)節(jié)：苛勒照明調(diào)節(jié)將相差物鏡及附件轉(zhuǎn)入光路,對樣品聚焦取下目鏡，裝上CT望遠(yuǎn)鏡，調(diào)節(jié)焦距看到清晰的相差環(huán)調(diào)節(jié)聚光鏡上定位螺絲，使環(huán)狀光闌象與相板共軛面重合〔四〕偏光觀察方式1原理依據(jù)波動光學(xué)原理觀察和精密測定標(biāo)本細(xì)節(jié),或透明物體改變光束的物理參數(shù),以此判別物質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種顯微鏡自然光〔多振動面〕偏振器1偏振器2偏振光〔單一振動面〕各向同性：單折射體，光性質(zhì)不因照射方向而改變，普通氣體、液體、非結(jié)晶固體等各向異性：雙折射體，光速度、折射率、吸收和振動面、振幅隨照射方向不同，晶體、纖維等〔四〕偏光觀察方式應(yīng)用：

礦物質(zhì)、化學(xué)物品鑒別鑒別纖維、染色體、淀粉粒、細(xì)胞中晶體植物病理檢驗鑒別骨骼、牙齒、膽固醇、神經(jīng)纖維、腫瘤細(xì)胞、橫紋肌和毛發(fā)等〔五〕微分干預(yù)〔DIC〕觀察方法〔五〕微分干預(yù)觀察方法1原理通過特制的棱鏡將偏振光分解相互垂直，強(qiáng)度相等的光束，光束載極近的兩點(diǎn)〔小于顯微鏡的分辨率〕上通過被檢物體，從而在相位上略有差異，使圖象呈現(xiàn)出立體三維感覺?！参濉澄⒎指深A(yù)觀察方法2特點(diǎn)可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺觀察效果更直觀無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好可以調(diào)節(jié)背景和物體的顏色變化而到達(dá)理想的效果?！参濉澄⒎指深A(yù)觀察方法3缺點(diǎn)需要光強(qiáng)高，雙折射物質(zhì)不能到達(dá)DIC鏡檢效果，不能應(yīng)用于塑料容器培養(yǎng)物的觀察，鏡檢靈敏度有方向性，調(diào)節(jié)較復(fù)雜4應(yīng)用：

無色透明活體標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)，無色熒光標(biāo)本，染色標(biāo)本，顯微操作等〔五〕微分干預(yù)觀察方法〔六〕浮雕相襯顯微鏡〔六〕浮雕相襯顯微鏡1原理斜射光照射到標(biāo)本產(chǎn)生折射、衍射，光線通過物鏡光密度梯度調(diào)節(jié)器產(chǎn)生不同陰影，從而使透明標(biāo)本外表產(chǎn)生明暗差異，增加觀察比照度。2.歷史1975年，RobertHoffman博士創(chuàng)造2002年，專利到期，各顯微鏡廠家紛紛推出采用以自己名義命名的RC技術(shù)產(chǎn)品3.特點(diǎn)提高未染色標(biāo)本的可見性和比照度；圖象顯示陰影或近似三維結(jié)構(gòu)而不會產(chǎn)生光暈；可檢測雙折射物質(zhì)(巖石切片、水晶、骨頭)；可檢測玻璃,塑料等培養(yǎng)皿中的細(xì)胞,器官和組織；聚光鏡的工作距離可以設(shè)計的更長；RC物鏡也可用于明場,暗場和熒光觀察〔六〕浮雕相襯顯微鏡4.缺點(diǎn)觀察效果與標(biāo)本方向密切相關(guān)操作較復(fù)雜必須有多元件,結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高數(shù)值孔徑RC物鏡觀察熒光效果不如明場物鏡5.應(yīng)用所有類型的細(xì)胞，組織〔無論活體，染色，未染色〕，晶體外表細(xì)節(jié)，透明聚合物，玻璃和其它類似材料，尤其適用于顯微操作〔六〕浮雕相襯顯微鏡熒光觀察方法什么是熒光?物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光，是非溫度輻射光——冷光。即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。顯微鏡熒光利用光源激發(fā)——光化熒光

熒光的種類

自發(fā)〔固有〕熒光二次熒光熒光的性質(zhì)吸收光，必需有激發(fā)光源熒光波長＞激發(fā)波長〔損失熱能〕熒光強(qiáng)度極小于激發(fā)光的強(qiáng)度有不同程度的衰減熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)光強(qiáng)度、被檢物濃度、熒光效率熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)和用途優(yōu)點(diǎn)：檢出能力高〔放大作用〕對細(xì)胞的刺激小〔可以活體染色〕能進(jìn)行多重染色用途：物體構(gòu)造的觀察——熒光素?zé)晒獾挠袩o、色調(diào)比較進(jìn)行物質(zhì)判別——抗體熒光等發(fā)熒光量的測定對物質(zhì)定性、定量分析熒光顯微鏡的種類

透射式熒光顯微鏡的種類

落射式熒光顯微鏡的主要部件

透射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡

落射式汞燈光源激發(fā)濾色鏡分色鏡吸收濾色鏡落射熒光顯微鏡的構(gòu)造吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡落射熒光顯微鏡的構(gòu)造熒光顯微鏡光源

汞燈光源:提供激發(fā)光(U、V、B、G)氙燈光源：頂峰值更寬，更穩(wěn)定熒光顯微鏡激發(fā)透鏡組

激發(fā)濾色鏡:

激發(fā)波長選擇激發(fā)透鏡組〔激發(fā)塊〕:

T%nmBANDPASS入射光發(fā)射光激發(fā)濾色鏡分光濾色鏡吸收濾色鏡落射熒光顯微鏡各部件特性和作用吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B透過＜B阻擋nmnmT%T%A落射熒光顯微鏡各部件特性和作用吸收濾色鏡:熒光透過,阻擋雜光分色鏡:反射激發(fā)光,熒光透過＞A透過A＜A反射B＞B，＜C透過nmnmT%T%AC濾色鏡的選擇熒光素的特性濾色鏡的特性激發(fā)分色吸收帶寬對圖象的影響SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI多重染色標(biāo)本的多色觀察FITC+TexasRed+DAPI三色濾色鏡的特性曲線激發(fā)分色吸收雙重染色標(biāo)本的單色和雙色觀察

WU

WIBDUAL

BANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI單色濾色鏡的特性曲線雙色濾色鏡的特性曲線現(xiàn)行顯微鏡特點(diǎn)和各種濾色鏡自由組合激發(fā)塊吸收濾色鏡激發(fā)濾色鏡分色鏡油鏡應(yīng)使用熒光油

物鏡光欄的運(yùn)用光欄全開啟光欄適當(dāng)關(guān)小減少雜散光干擾熒光的衰減

防衰減的方法使用抗衰減劑選擇衰減小的熒光素降低激發(fā)光強(qiáng)度降低標(biāo)本中氧的濃度有衰減的標(biāo)本使用抗衰減劑的效果汞燈燈箱構(gòu)造燈室，上下、左右旋鈕，聚光鏡旋鈕汞燈中心調(diào)節(jié)方法放置熒光調(diào)中板或一張白紙于載物臺上轉(zhuǎn)入B或G激發(fā)濾色鏡用10X物鏡觀察并聚焦取下10X物鏡通過汞燈箱上聚焦旋鈕聚焦汞燈電極于白紙通過汞燈箱上下、左右旋鈕調(diào)汞燈電極中心于白紙上圓環(huán)中心1.明場觀察——常