分離純化的后期步驟

關(guān)于分離純化的后期步驟11.1樣品的濃縮生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮

2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮3、冰凍法4、吸收法5、超濾法6、其他第2頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮

通過(guò)降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。第3頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過(guò)空氣流；或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對(duì)準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過(guò)膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。第4頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、冰凍法生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。第5頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、吸收法通過(guò)吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)生物大分子不吸附，易與溶液分開(kāi)。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。

第6頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、超濾法超濾法是使用一種特別的薄膜對(duì)溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法，不液體在一定壓力下（氮?dú)鈮夯蛘婵毡脡海┩ㄟ^(guò)膜時(shí)，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻保留，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。第7頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、吹干濃縮法

將蛋白溶液裝入透析袋內(nèi)，放在電風(fēng)扇下吹。此法簡(jiǎn)單，但速度慢，且溫度不能過(guò)高，最好不要超過(guò)15℃。第8頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天7、凝膠濃縮法

選用孔徑較小的凝膠，如SephadexG25或G50，將凝膠直接加入蛋白溶液中。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。放入冰箱內(nèi)，凝膠粒子吸水后，通過(guò)離心除去。濃縮后，蛋白質(zhì)的回收率可達(dá)80％～90％。比濃縮膠應(yīng)用方便，直接加入被濃縮的溶液中即可。必須注意，濃縮溶液的pH值應(yīng)大于被濃縮物質(zhì)的等電點(diǎn)，否則在濃縮膠表面產(chǎn)生陽(yáng)離子交換，影響濃縮物質(zhì)的回收率。第9頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.2干燥生物大分子制備得到產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類生物大分子的干燥保存。第10頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.3結(jié)晶結(jié)晶對(duì)酶的重要意義作為純化的方法之一作為均勻性的證據(jù)作為穩(wěn)定的貯存方法單晶可以作為X-衍射分析的材料常用的結(jié)晶方法等電點(diǎn)結(jié)晶法鹽析結(jié)晶法透析結(jié)晶法溫差結(jié)晶法第11頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.4貯存生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定，在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)（內(nèi)裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態(tài)貯藏時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。第13頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對(duì)某些酶也有一定保護(hù)作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中。

3、貯藏溫度要求低，大多數(shù)在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應(yīng)視不同物質(zhì)而定。第14頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.5純度鑒定電泳法沉降法分光光度法：A280/260=1.75恒溶解度法結(jié)晶法：免疫法第15頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.6蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定方法1.沉降離心法：M=RTS/D（1-

）2.滲透壓法：M=gRT/PC3.電泳法：lgM=a－bRf4.分子篩法：lgM=a－bVe5.最小分子量法：蛋白質(zhì)最小分子量＝100*金屬原子量／該金屬在該蛋白質(zhì)中的百分含量第16頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.7蛋白質(zhì)（酶）含量的測(cè)定方法凱氏(Kjedahl)定氮法雙縮脲反應(yīng)紫外光分光度法染料結(jié)合法之一水揚(yáng)酸比色法Folin試劑法（Lowry法）第17頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天11.8分離純化步驟的設(shè)計(jì)與方法的選擇原則純化步驟的評(píng)價(jià)第18頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第19頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天原則（1）明確分離純化的目的

(2)所分離的物質(zhì)的性質(zhì)（3）原料的特性與數(shù)量（4）時(shí)間（5）實(shí)驗(yàn)條件（6）各種方法的原理特性和優(yōu)缺點(diǎn)（7）各種方法的使用順序安排要合理（8）快速穩(wěn)定的活力與含量的測(cè)定方法（9）操作過(guò)程中各種因素的影響第20頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第21頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白純化的基本策略捕獲階段：目標(biāo)是澄清、濃縮和穩(wěn)定目標(biāo)蛋白。

中度純化階段：目標(biāo)是除去大多數(shù)大量雜質(zhì)，如其它蛋白、核酸、內(nèi)毒素和病毒等。

精制階段：除去殘余的痕量雜質(zhì)和必須去除的雜質(zhì)。第22頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第23頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天分離方法的選擇根據(jù)蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)采用不同的分離方法第24頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)溶解度不同的分離方法等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、PEG沉淀法根據(jù)分子大小不同的分離方法透析/超過(guò)濾、分子篩、離心法根據(jù)分子帶電性不同的分離方法離子交換層析、電泳法根據(jù)分子吸附性不同的分離方法吸附層析、親和層析第25頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)的性質(zhì)方法電荷（等電點(diǎn)）離子交換（IEX）分子量凝膠過(guò)濾（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特異性結(jié)合親和（AC）第27頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天每一種方法都有分辨率、處理量、速度和回收率之間的平衡分辨率：由選擇的方法和層析介質(zhì)生成窄峰的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)?？偟膩?lái)說(shuō)，當(dāng)雜質(zhì)和目標(biāo)蛋白性質(zhì)相似時(shí)，在純化的最后階段分辨率是重要因素。

處理量：一般指在純化過(guò)程中目標(biāo)蛋白的上樣量。如上樣體積、濃度等。

速度：在初純化中是重要因素，此時(shí)雜質(zhì)如蛋白酶必須盡快除去。

回收率：隨著純化的進(jìn)行漸趨重要，因?yàn)榧兓a(chǎn)物的價(jià)值在增加。第28頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天技術(shù)主要特點(diǎn)捕獲中度純化精制樣品起始狀態(tài)樣品最終狀態(tài)IEX高分辨率高容量高速度★★★★★★★★★低離子強(qiáng)度樣品體積不限高離子強(qiáng)度或pH改變。樣品濃縮HIC分辨率好容量好高速度★★★★★★高離子強(qiáng)度樣品體積不限低離子強(qiáng)度樣品濃縮AC高分辨率高容量高速度★★★★★★★★結(jié)合條件特殊樣品體積不限洗脫條件特殊樣品濃縮GF高分辨率（使用Supedex）

★★★★樣品體積（<總柱體積的5%）和流速范圍有限制緩沖液更換（如果需要）樣品稀釋RPC高分辨率

★★★★需要有機(jī)溶劑在有機(jī)溶劑中，有損失生物活性的風(fēng)險(xiǎn)在三階段純化策略中每一種方法的適用性

第29頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第30頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共35頁(yè)，2024年2月25日，星期天提示：1、

通過(guò)組和各種方法使純化步驟之間的樣品處理減至最少，以避免需要調(diào)節(jié)樣品。第一個(gè)步驟的產(chǎn)物的洗脫條件應(yīng)適宜于下一個(gè)步驟的起始條件。2、

硫酸銨沉淀是常用的樣品澄清和濃縮方法，所以HIC是捕獲階段的理想方法。3、

GF很適宜在由濃縮效應(yīng)的方法（IEX、HIC、AC）后使用，凝膠過(guò)濾對(duì)上樣體積有限制，但不受緩沖液條件的影響。4、

在捕獲階段選擇對(duì)目標(biāo)蛋白具有最高選擇性或／和處理量的方