大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)

關(guān)于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)及發(fā)酵技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的概述動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)：無細(xì)胞壁倍增時(shí)間長，生長緩慢需氧量少，對(duì)攪拌敏感聚集體形成原代細(xì)胞培養(yǎng)50代即開始退化第2頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概述動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的定義：動(dòng)物細(xì)胞與組織培養(yǎng)是從動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)胞或組織，模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞或者組織生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)第3頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概述生長特性貼壁生長型：如人胚肺細(xì)胞，Hela細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞懸浮生長型：如血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等第4頁,共42頁，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)細(xì)胞的基本技術(shù)體外培養(yǎng)特點(diǎn)體外培養(yǎng)工具體外培養(yǎng)條件體外細(xì)胞生長增殖過程培養(yǎng)方法大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第5頁,共42頁，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的特點(diǎn)營養(yǎng)條件苛刻適應(yīng)性差，敏感培養(yǎng)時(shí)間長，易污染第6頁,共42頁，2024年2月25日，星期天體外培養(yǎng)的條件溫度，37℃pH：7.2-7.4氣體：氧，二氧化碳，氮?dú)鉅I養(yǎng)條件：需要多種氨基酸，維生素，輔酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生長因子，其中多種成分可由血清提供第7頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)

第8頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法反應(yīng)器貼壁培養(yǎng)容易換液，不需特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可采用灌流培養(yǎng)獲得高密度，但擴(kuò)大規(guī)模較難，適合制備量小，價(jià)值高的生物藥品。（CelliGenPlusTM）微載體培養(yǎng)最有前途的動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，兼有懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline）無血清懸浮培養(yǎng)用已知人源或動(dòng)物來源的蛋白或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第9頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù)pH溶氧溫度谷氨酸/谷氨酰胺葡萄糖乳酸CO2第10頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中重要參數(shù)NH4+K+/Na+Ca++滲透壓細(xì)胞密度第11頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題細(xì)胞凋亡細(xì)胞在高密度條件下，由于細(xì)胞的多層生長，存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)，細(xì)胞的生長和表達(dá)均受到嚴(yán)重影響第12頁,共42頁，2024年2月25日，星期天動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)存在的問題細(xì)胞凋亡主要是細(xì)胞生長的條件較惡劣，包括：1.營養(yǎng)缺乏2.有害代謝產(chǎn)物的積累3.pH和溶氧控制不當(dāng)4.機(jī)械攪拌剪切力較大5.滲透壓第13頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用生產(chǎn)疫苗蛋白質(zhì)和多肽藥物基因治療單抗第14頁,共42頁，2024年2月25日，星期天微生物培養(yǎng)技術(shù)概述傳統(tǒng)：釀酒、抗生素、制醋基因工程：生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物、疫苗等（大腸桿菌、酵母）一般采用高密度發(fā)酵技術(shù)第15頁,共42頁，2024年2月25日，星期天微生物培養(yǎng)培養(yǎng)過程決定于：菌種培養(yǎng)條件第16頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

微生物培養(yǎng)過程重要參數(shù)：溫度pH溶氧葡萄糖/甘油乙酸第17頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

乳酸NH4+磷酸鹽乙醇(酵母)甲醇(酵母)細(xì)胞密度第18頁,共42頁，2024年2月25日，星期天微生物高密度培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基表達(dá)基因的調(diào)控宿主菌質(zhì)粒的拷貝數(shù)及穩(wěn)定性第19頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

高密度培養(yǎng)的關(guān)鍵是發(fā)酵的補(bǔ)料控制,根據(jù)重組菌的生長特點(diǎn)及產(chǎn)物的表達(dá)方式采取合理的營養(yǎng)物質(zhì)的流加方式恒速流加變速流加指數(shù)流加第20頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

微生物高密度培養(yǎng)乙酸的形成:培養(yǎng)液中葡萄糖的含量超過菌體生長所需量或在缺氧的情況下,便會(huì)大量產(chǎn)生乙酸.減少乙酸的策略:限制性流加葡萄糖甘油代替葡萄糖降低培養(yǎng)溫度第21頁,共42頁，2024年2月25日，星期天

宿主菌降低比生長速率透析培養(yǎng)第22頁,共42頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵中的重要參數(shù)了解生物技術(shù)的應(yīng)用GlucoseGlutamineAmmoniaLactate第23頁,共42頁，2024年2月25日，星期天pH不同的細(xì)胞具有不同最佳pH范圍pH能影響葡萄糖和谷氨酰胺的代謝，在低pH條件下，葡萄糖消耗速度慢

pH能影響細(xì)胞的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的量

第24頁,共42頁，2024年2月25日，星期天CO2在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，CO2

與碳酸氫鹽形成緩沖對(duì)，穩(wěn)定培養(yǎng)液中的pHCO2也可用于計(jì)算呼吸商，反應(yīng)細(xì)胞活力和代謝旺盛程度細(xì)胞代謝（呼吸作用）會(huì)產(chǎn)生CO2(廢物)CO2

水平增加會(huì)抑制細(xì)胞生長和細(xì)胞活性，從而影響目標(biāo)蛋白的表達(dá)，當(dāng)溶液中CO2達(dá)到14-15%時(shí)，會(huì)嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長CO2+H2O<<>>H2CO3<<>>H++HCO3-第25頁,共42頁，2024年2月25日，星期天DO(溶氧）葡萄糖等需氧來氧化產(chǎn)生ATP供細(xì)胞的能量用于測量和跟蹤細(xì)胞消耗氧的速率.

第26頁,共42頁，2024年2月25日，星期天溶氧在細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，O2通常是限制營養(yǎng)成分，是因?yàn)樗谌芤褐械腿芙舛?通常關(guān)心對(duì)培養(yǎng)液中%O2,也就是“溶氧”值(DO):理論DO:80%+/-5%(哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng))>90%DO2(細(xì)菌培養(yǎng)）O2也可能通過自由基形成對(duì)細(xì)胞造成傷害,在低pO2

水平，細(xì)胞的活性通常越高

(O2值必須維持在最低的水平)然而,原代細(xì)胞可能在低O2

條件下繁殖受延遲

因而，維持正確的O2的平衡，對(duì)保證所有細(xì)胞正確生長都非常重要,一般30-50%第27頁,共42頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖葡萄糖兩個(gè)主要的功能:細(xì)胞的主要的能量物質(zhì)主要的細(xì)胞碳源

葡萄糖和谷氨酰胺是相互補(bǔ)充的:產(chǎn)生其他代謝物(例如:天冬氨酸)提供能量在所有細(xì)胞中通過糖酵解途徑轉(zhuǎn)變成丙酮.

葡萄糖的代謝隨細(xì)胞生長而增加.葡萄糖通常是細(xì)胞生長的限制因素第28頁,共42頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖監(jiān)控細(xì)胞反應(yīng)器和發(fā)酵罐中的葡萄糖水平:保證細(xì)胞正常生長所需能量.開發(fā)延長細(xì)胞培養(yǎng)周期的標(biāo)準(zhǔn)補(bǔ)料策略.計(jì)算葡萄糖消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的起始濃度.第29頁,共42頁，2024年2月25日，星期天乳酸=氧化問題在培養(yǎng)過程中，大多數(shù)乳酸來自于葡萄糖代謝，但也有一部分來自于谷氨酰胺代謝.基于高細(xì)胞密度和深液位，氧的消耗非常大.典型的范圍(組織培養(yǎng)):0-5g/LO2

消耗導(dǎo)致乳酸的形成，最終導(dǎo)致pH的下降.對(duì)恒定的pH:抑制細(xì)胞生長的乳酸水平在低到4mM到高達(dá)70mM(取決于細(xì)胞).在大多數(shù)情況下，銨對(duì)細(xì)胞生長的抑制比乳酸更嚴(yán)重.第30頁,共42頁，2024年2月25日，星期天乳酸監(jiān)控長時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)中乳酸的積累.計(jì)算乳酸產(chǎn)量與葡萄糖的消耗之間的代謝關(guān)系考察乳酸鹽對(duì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的毒害影響第31頁,共42頁，2024年2月25日，星期天銨細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵中銨的來源:主要來源:代謝谷氨酰胺(谷氨酰胺降解)谷氨酰胺降解成銨和吡咯烷酮酸其他氨基酸的脫氨基作用

銨的水平也取決于細(xì)胞密度和細(xì)胞代謝方式.引起細(xì)胞抑制的銨離子濃度范圍:從: 0.5mM(LMouseCells)到: 40.0mM(M.AscitesTumorCells)

(不同的細(xì)胞株對(duì)銨有不同的耐受度)第32頁,共42頁，2024年2月25日，星期天銨pH會(huì)受NH3增加的影響:

NH4+<<>>NH3+H+

銨的增加也會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng).監(jiān)控發(fā)酵罐和生物反應(yīng)器中銨的水平（廢物）.

推算谷胺酰胺的降解水平.

考察銨濃度對(duì)細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度的影響.監(jiān)控引入培養(yǎng)基的質(zhì)量.第33頁,共42頁，2024年2月25日，星期天限制銨抑制的策略增加換液的速率(補(bǔ)料).維持培養(yǎng)液中低的谷氨酰銨濃度減少其轉(zhuǎn)化和降解.在低的pH培養(yǎng)減少NH3形成.

去除培養(yǎng)液中的銨:酶轉(zhuǎn)化通過特殊的

“PTFE”

膜將NH3擴(kuò)散到低pH溶液中使用能夠逐步接受高NH3

濃度的細(xì)胞第34頁,共42頁，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺與葡萄糖一樣,谷氨酰胺也是細(xì)胞的主要物質(zhì):

*碳和氮 *能量谷氨酰胺通常被認(rèn)為是細(xì)胞培養(yǎng)的主要限制營養(yǎng)谷氨酰胺是生物合成的前體物質(zhì):

*嘌呤 *嘌呤核苷谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受體第35頁,共42頁，2024年2月25日，星期天谷氨酰胺監(jiān)控谷氨酰胺的水平:確保細(xì)胞生長所需的能量.

開發(fā)長時(shí)間細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化補(bǔ)料策略.

計(jì)算谷氨酰胺的消耗速率和決定批次培養(yǎng)最佳的其始濃度.第36頁,共42頁，2024年2月25日，星期天谷氨酸需用來計(jì)算谷氨酰胺需確證谷氨酸的濃度，確保沒加進(jìn)谷氨酰胺結(jié)果.谷氨酰胺的降解產(chǎn)物第37頁,共42頁，2024年2月25日，星期天Na/KNa-K:對(duì)合適培養(yǎng)基生產(chǎn)很重要.維持溶液/培養(yǎng)基合適的離子強(qiáng)度.第38頁,共42頁，2024年2月25日，星期天滲透壓滲透壓是溶液濃度的一個(gè)反應(yīng):測定滲透壓的參考方法是使用滲透壓計(jì)典型細(xì)胞培養(yǎng)液滲透壓值:

300+/-30mOsmol/kg.滲透壓升高50-100mOsmol/kg會(huì)明顯影響某些細(xì)胞的生長.某些溶液/化合物可作為滲透壓的保護(hù)劑(維持滲透壓穩(wěn)定和更低).這些物質(zhì):

甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸第39頁,共42頁，2024年2月25日，星期天滲透壓用于對(duì)引進(jìn)的培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量控制關(guān)聯(lián)滲透壓與細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活性和產(chǎn)量的關(guān)系監(jiān)控