植物基因表達的啟動子

關(guān)于植物基因表達的啟動子

真核啟動子比原核更復(fù)雜、序列也更長，它不像原核啟動子那樣有明顯共同一致的序列，而且單靠RNA聚合酶難以起動轉(zhuǎn)錄，而是需要多種蛋白質(zhì)因子的相互協(xié)調(diào)作用。不同真核啟動子之間大小、序列很不相同。不同物種的啟動子有時不能互用，如動物和植物之間。

真核啟動子中包含了許多調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的元件，它們控制著基因表達的強弱或者時空差異。根據(jù)對基因表達的必須性，這些元件分為2類：核心啟動子元件和上游啟動子元件第2頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

（1）TATA框(TATAbox)：位于5′端轉(zhuǎn)錄起始點上游約20-30個核苷酸的地方。TATA框是一個短的核苷酸序列，其堿基順序為TATAATAA。TATA框是RNA聚合酶的重要的接觸點，它能夠使酶準(zhǔn)確地識別轉(zhuǎn)錄的起始點并開始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)TATA框中的堿基順序有所改變時，mRNA的轉(zhuǎn)錄就會從不正常的位置開始。（2）CAAT框(CAATbox)：位于5′端轉(zhuǎn)錄起始點上游約70-80個核苷酸的地方。CAAT框是啟動子中另一個短的核苷酸序列，其堿基順序為GGCTCAATCT。CAAT框是RNA聚合酶的另一個結(jié)合點，一般認(rèn)為它控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率，而不影響轉(zhuǎn)錄的起始點。當(dāng)這段順序被改變后，mRNA的形成量會明顯減少。1.核心啟動子元件(corepromoterelement):

指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括TATA盒和CAAT盒。核心元件單獨起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。第3頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

11281tttcccgccttcagtttagcttcatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaac11341tcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaaga11401aaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagata11461cagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacc11521tcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaag11581gtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctg11641ccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacg11701ttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatg11761acgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctat

ataaggaagttcatttcatt11821tggagagaacacgggggactcttgac花椰菜花葉病毒35S啟動子=CaMV35S啟動子TATA框(TATAbox)CAAT框(CAATbox)第4頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

2.上游啟動子元件(upstreampromoterelement):包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點更遠的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件，其位置也不相同，這使得不同的基因表達分別有不同的時間與空間表達調(diào)控。這些上游啟動子元件中，最普遍的是增強子元件。第5頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3.增強子（enhancer）

是一種能夠提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件。最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物和原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子。增強子通常長100－200bp，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為8－12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強子的作用有以下特點：第6頁,共44頁，2024年2月25日，星期天①增強子可以遠距離作用。通?？删嚯x1-4kb、個別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。②增強子作用與其序列的正反方向無關(guān)。將增強子方向倒置依然能起作用。而將啟動子倒就不能起作用，可見增強子與啟動子是很不相同的。第7頁,共44頁，2024年2月25日，星期天③增強子要有啟動子才能發(fā)揮作用。沒有啟動子存在，增強子單獨不能表現(xiàn)活性。④增強子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性。同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。例如當(dāng)含有增強子的病毒基因組整合入宿主細胞基因組時，能夠增強整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)增強子隨某些染色體段落移位時，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。第8頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第9頁,共44頁，2024年2月25日，星期天帶增強子的35S啟動子第10頁,共44頁，2024年2月25日，星期天4.靜止子(silencer)

最早在酵母中發(fā)現(xiàn)，以后在T淋巴細胞的T抗原受體基因的轉(zhuǎn)錄和重排中證實這種負(fù)調(diào)控順式元件的存在。目前對這種在基因轉(zhuǎn)錄降低或關(guān)閉中起作用的序列研究還不多，但從已有的例子看到：靜止子的作用可不受序列方向的影響，也能遠距離發(fā)揮作用，并可對異源基因的表達起作用。第11頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.組成型啟動子可以在所有細胞、組織和器官中持續(xù)發(fā)揮作用的啟動子。如看家基因的啟動子。組成型啟動子用來控制基因的持續(xù)表達，如抗病、抗蟲、抗不良環(huán)境的基因。在植物基因工程中，用于控制基因組成型表達的啟動子主要有2個來源：微生物和植物。二、啟動子的類型第12頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.1病毒來源的組成型啟動子—CaMV35S啟動子CaMV35S啟動子是花椰菜花葉病毒（cauliflowermosaicvirus，CaMV)雙鏈DNA病毒基因組中啟動35SRNA基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，CaMV35Spromoter，它可以利用宿主細胞核RNA聚合酶進行基因轉(zhuǎn)錄，并且不依賴于病毒的產(chǎn)物。第13頁,共44頁，2024年2月25日，星期天35S啟動子的結(jié)構(gòu)+9-90-343DomainA

DomainB

DomainA:與在根部起作用有關(guān)。DomainB：是煙草轉(zhuǎn)錄因子ASF-1的結(jié)合部位，與在植物葉片、莖等綠色組織中起作用有關(guān)。上游部分：與轉(zhuǎn)錄強度有關(guān)（增強子功能）。含有重復(fù)的-343—-90部分的35S啟動子比350bp的35S啟動子的強度大10倍。35S啟動子的核心長度為60bp左右；其上游有其它元件，控制啟動子的轉(zhuǎn)錄效率和特異性，其中包括增強子。增強子第14頁,共44頁，2024年2月25日，星期天CaMV35S啟動子是一個組成型啟動子，不僅可以能在雙子葉植物中高效啟動基因表達，而且在許多單子葉植物中也可以高效啟動基因表達。另外CaMV35S啟動子內(nèi)部沒有我們常用的酶切位點，因而容易克隆和使用，在植物基因工程中得到了廣泛的應(yīng)用。35S啟動子控制的GUS基因在煙草中表達莖葉片橫切面根花幼苗第15頁,共44頁，2024年2月25日，星期天由于CaMV35S啟動子在植物中成功的應(yīng)用，人們也克隆了其它病毒的啟動子，如cassava（木薯）veinmosaicvirus(CsVMV)promoter

，Australianbananastreakvirus(BSV)promoters，mirabilismosaicvirus(MMV)promoterandfigwort（玄參）mosaicvirus(FMV)promoter，這些啟動子也能夠在植物中高效高效啟動基因的轉(zhuǎn)錄。第16頁,共44頁，2024年2月25日，星期天

利用病毒來源的啟動子進行植物轉(zhuǎn)基因有令人擔(dān)心的問題，如：轉(zhuǎn)基因食物與感染人類的病毒存在時，啟動子可能與病毒基因重組、導(dǎo)致病毒基因的大量表達。植物細胞可能不識別病毒來源的啟動子序列，把它當(dāng)作外源DNA，對它進行修飾、使它失去作用，導(dǎo)致基因沉默。第17頁,共44頁，2024年2月25日，星期天原核生物組成型啟動子之二：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶基因啟動子NospromoterNospromoter35SpromoterNospromoter煙草衛(wèi)矛第18頁,共44頁，2024年2月25日，星期天1.2植物來源的組成型啟動子

在植物中有很多看家基因，在各種類型細胞和所有時間內(nèi)都表達。啟動這些基因表達的啟動子就是組成型啟動子?，F(xiàn)在許多這類啟動子已經(jīng)被克隆，并在植物基因工程得到了應(yīng)用。

肌動蛋白（actin）是細胞基本骨架的成分，actin基因家族的基因都是組成型基因，其啟動子就是組成型啟動子。通過檢測報告基因的表達，發(fā)現(xiàn)1.5kb的擬南芥actin2基因啟動子幾乎在擬南芥所有器官和整個發(fā)育過程中都起作用，僅在種皮、胚軸、子房和花粉囊中不起明顯作用。

水稻的actin1基因啟動子僅不在木質(zhì)部中起作用。第19頁,共44頁，2024年2月25日，星期天擬南芥ACTIN2基因啟動子分析第20頁,共44頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共44頁，2024年2月25日，星期天Ubiquitin（泛素蛋白）也是細胞中重要的基本成分，參與了許多重要生命過程，如蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA修復(fù)等。來自玉米的Ubiquitin1基因的啟動子（pUbi）是用得比較多的植物啟動子之一，特別是在單子葉植物中，在玉米中pUbi的作用是35S啟動子的10倍。來自煙草的Ubi.U4基因的啟動子(-263bp)在煙草中的作用比35S啟動子好。第22頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.特異啟動子

在基因工程中利用組成型啟動子高表達基因常常帶來許多麻煩，如影響植物的正常生長發(fā)育，轉(zhuǎn)基因植物安全性等問題，所以我們希望在時空上能夠控制基因的表達，因此就要用細胞、組織、器官特異啟動子。轉(zhuǎn)35S-Kn1-Nos基因的煙草轉(zhuǎn)35S-Kn1-Nos基因的地黃第23頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.1組織特異啟動子（tissue-specificpromoter）就是只在特定的組織或者器官（根、葉片、子房、花粉、花原基、種皮等）中起作用的啟動子。植物維管組織特異啟動子第24頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.2果實特異性啟動子果實是食用器官，利用果實特異性啟動子可以改良果實品質(zhì)、生產(chǎn)疫苗。蘋果和番茄果實中1-aminocyclopropane-1-carboxylate(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸，ACC)oxidasegene（E8gene）和polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶，PG)genes啟動子在果實成熟是起作用。番茄PG啟動子用來提高番茄果實中胡蘿卜素的含量；番茄E8啟動子表達virus-Fprotein，生產(chǎn)疫苗，提高了老鼠系統(tǒng)免疫能力。第25頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.3種子/籽粒特異啟動子種子/籽粒是很多植物的收獲器官，具有重要經(jīng)濟價值，其質(zhì)量和品質(zhì)一直受到人們的關(guān)注，如食品中蛋白質(zhì)、油脂、維生素的含量提高、棉花纖維長度的提高、有用物質(zhì)（蛋白、酶、疫苗的生產(chǎn)等）都可以通過種子/籽粒特異啟動子啟動有關(guān)基因的表達而實現(xiàn)。這類啟動子有：soybeanβ-conglycinin基因啟動子在胚成熟的中、后期起作用；sunflowerhelianthinin基因啟動子在發(fā)育的種子中起作用；Frenchbeanβ–phaseolin基因啟動子只在發(fā)育的種子的胚乳和胚起作用；cottona-globulin基因啟動子可以在棉花、煙草、擬南芥發(fā)育的種子中起作用。種皮特異啟動子：Apeaβ-1,3-glucanase基因（PsGNS2）只在種皮中起作用。第26頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.4塊根/塊莖儲藏器官特異啟動子B33andPAT21是土豆的糖蛋白的主要成員，分析表明B33andPAT21基因的表達最主要是在塊莖形成的過程中，表明B33andPAT21基因的啟動子是塊莖特異性的。

Sporamin（紅薯特殊貯藏蛋白）andβ-淀粉酶是紅薯塊根中2個主要的可溶性蛋白，研究表明Sporamin幾乎都在塊根中表達（1%–4.5%在莖中)。第27頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.5花/花序特異啟動子

花是重要的觀賞器官，花色、花形、花的壽命和香氣等是花卉重要性狀。

1.45kb的菊花內(nèi)源ubiquitinextensionprotein基因啟動子(UEP1)在花中的作用是在葉片中作用的9倍，比CaMV35S啟動子在菊花中的作用高40–85倍?？刂茢M南芥花瓣中蠟質(zhì)合成的基因（CER6）啟動子也可以在菊花花瓣中特異起作用。擬南芥leafy,ap1,ap3，PI等花器官發(fā)育基因的啟動子第28頁,共44頁，2024年2月25日，星期天Pleafy-barnase-Tnos無花植物表達載體第29頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.6花粉/花藥特異啟動子

煙草花粉特異啟動子TA29,番茄花粉特異啟動子lat52，水稻花粉特異RA8gene啟動子、玉米ZmC5基因啟動子、ZM13啟動子都是花粉特異啟動子.

花粉特異啟動子被廣泛用來創(chuàng)造核雄性不育植物?；ǚ厶禺悊幼莹Cbarnase(RNase)載體已經(jīng)用來轉(zhuǎn)煙草、油菜、水稻、玉米等；花粉特異啟動子還可以進行基因刪除，防止外源基因通過花粉污染其它非轉(zhuǎn)基因（作物）植物，提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。第30頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.7根特異啟動子Agrobacteriumrhizogenes

rolD

基因啟動子（373-426bp）、90bp的35S啟動子具有根特異性；煙草的TobRB7啟動子、Arabidopsisthalianapyk10啟動子、松樹PmPR10-1.14啟動子。第31頁,共44頁，2024年2月25日，星期天(A)2-day-oldseedling;(B)3-day-oldseedlingshowingGUS-stainingthroughoutthewholeplant,withexceptionoftheelongationzoneoftheroot;(C)5-day-oldseedlingwithareductionofgus-activityincotyledons;(D)7-day-oldseedlingshowingthatthehypocotylisnomorestained;(E)10-day-oldseedlingwithnoGUS-stainingintheupperpartsoftheplant;(F)14-day-oldseedling;(G)stainedrootsshowinggus-activityalongthewholemainroot;(H)transitionzonebetweenhypocotyleandroot.(I–T)Gus-activityundercontrolofthepromoterconstructC,(I)2-day-oldseedling;(K)3-day-oldseedling;(L)5-day-oldseedling;(M)7-day-oldseedlingwithoutGUS-staininginthehypocotyl;第32頁,共44頁，2024年2月25日，星期天(N)10-day-oldseedlingshowingGUS-stainingincotyledons,inthemidribregionandmarginalpartsoftheleavesandinhydathodes;(O)14-day-oldseedlingwithastrongreductionofgus-activityintheupperpartoftheplant;(P)stainedrootsshowingastronggus-activityalongthewholemainroot;(Q)close-upofstainedrootsshowinggus-activitypreponderantlyinthecentralregionoftherootorinthewholeroot;(R)close-upofastainedrootshowinggus-activityintheouterpartsoftheroot;(S)close-upofstainedroottipsandroothairs;(T)lateralrootswithGUS-stainingonlyintheroottip;(U–W)stainedcrosssectionsofmainroots;(X)stainedcrosssectionneartheroottip;(Y)close-upofapodabscissionsite.第33頁,共44頁，2024年2月25日，星期天根特異啟動子在提高植物利用肥料、適應(yīng)土壤環(huán)境、提高對土壤病害抗性等基因過程方面具有重要作用第34頁,共44頁，2024年2月25日，星期天2.8葉片/綠色組織特異啟動子屬于光誘導(dǎo)型啟動子研究最清楚的是編碼ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase（1，5-二磷酸核酮糖羧化酶）小亞基的rbcSmultigenefamily的啟動子。另外，chlorophylla/b-binding(Cab)proteingenes的啟動子.。第35頁,共44頁，2024年2月25日，星期天細胞器特異啟動子

葉綠體基因工程：在葉綠體表達外源基因。優(yōu)點：1）葉綠體基因組小，沒有位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因不會沉沒；2）表達量高，可以達到10000葉綠體/細胞；3）花粉中沒有葉綠體，所以沒有基因逃逸，安全。

Chloroplasttransformationvectorsmostoftenincludealight-responsivepromoterpsbA,aphotosystemIIpromoter，andrbcL,thepromoterfortheribulose-1,5-bisphophatecarboxylaselargesubunitgene,andthe16SrRNA(Prrn),astrongandconstitutiveplastidoperonpromoter.第36頁,共44頁，2024年2月25日，星期天葉綠體基因工程在植物抗蟲、抗除草劑、生產(chǎn)藥物蛋白方面具有極大的優(yōu)勢。研究表明，葉綠體基因工程培育的抗除草劑植物的抗性有時比核轉(zhuǎn)基因的高10000倍第37頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3.誘導(dǎo)型啟動子（InduciblePromoters）特異啟動子是依靠植物自身的能力實現(xiàn)基因的不同時空表達，利用誘導(dǎo)型啟動子則可以人們主動控制基因表達。3.1Stress/wound-induciblepromoters：病原菌、害蟲、低溫、高溫、水澇、干旱、高鹽、創(chuàng)傷等都可以引起植物的一些特殊反應(yīng)（基因表達的結(jié)果），由此而得到一些受這些因素誘導(dǎo)的啟動子。馬鈴薯創(chuàng)傷啟動子wun1（創(chuàng)傷啟動子）andproteinaseinhibitorII(pin2，蛋白酶抑制劑)genepromotersbothdirecthighwound-andpathogen-inducibleexpression,buthavelittletonoconstitutiveexpressionwithoutstimulus。The1.2kbwun1promoterfusedtoreportergenesshowedveryhighlevelsofexpressionatthesiteofwoundingandpathogenattack。Reportergeneinductionwasmaximalat10h.TheArabidopsisrd29Aandrd29B基因啟動子受到干旱、高鹽的誘導(dǎo)。第38頁,共44頁，2024年2月25日，星期天3.2外源誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)優(yōu)點：1）可以隨意控制（誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)的劑量）；2）重復(fù)控制；3）植物內(nèi)部背景低。Mostinducible/repressiblepromotersystemsaretwo-componentsystemswithmolecular‘on-off’switchesthatvaryincomplexity.Theyincludeatranscriptionfactorgenewhoseproduct,whenselectivelyexpressed,bindstoa‘target’promoterthatcontainsthetranscriptionfactor’scis-actingelement.Thetargetpromoterisfusedtothetransgeneofinterestandthebindingofthetranscriptionfactormodulatesitsexpression第39頁,共44頁，2024年2月25日，星期天35S啟動子轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄因子+誘導(dǎo)劑（Cu2+,酒精,等)基因表達外源誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)作用示意圖結(jié)合轉(zhuǎn)錄功能基因誘導(dǎo)型啟動子第40頁,共44頁，2024年2月25日，星期天乙醇誘導(dǎo)系統(tǒng):Itiscomposedofthepromoterofthealcoholdehydrogenasegene,alcA,andanalcoholactivatedtranscriptionfactorgene(alcR)drivenbytheCaMV35Spromoter.Thetranscriptionfactor(ALCR)bindsinthepresenceofethanoltospecificsitesinachimericalcA:CaMV35Sminimalpromoter(TATAboxregion),activatingtranscriptionofatargetgene.Thealcsystemisextremelysensitivetoethanolandisinducedrapidlyandinadose-dependentmanne