分子雜交與印跡技術(shù)

關(guān)于分子雜交與印跡技術(shù)一、變性與復(fù)性

（一）變性

1、定義：在一定的條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成無規(guī)則線團(tuán)，雙鏈解鏈成為單鏈。第一節(jié)核酸分子雜交的基本原理第2頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、變性的方法：（1）熱變性：溫度升高到90~100℃時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵完全斷裂。（2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時(shí)，雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。（3）化學(xué)試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。第3頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3、變性后的理化性質(zhì)變化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加第4頁,共65頁，2024年2月25日，星期天4、DNA變性曲線

AT區(qū)先解鏈

GC區(qū)后解鏈階梯式曲線第5頁,共65頁，2024年2月25日，星期天5、GC含量與Tm值之間的關(guān)系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3融解溫度：

定義：在DNA熱變性時(shí)，其A260的升高達(dá)最大值一半時(shí)的溫度。第6頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）復(fù)性

1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸都可互補(bǔ)形成雙鏈：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第7頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、復(fù)性過程（1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈（2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對(duì)時(shí)，雙鏈重新解離（3）局部雙鏈周圍的堿基如配對(duì)，則形成中心序列（4）形成完整的雙鏈分子第8頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3、復(fù)性的速率方程（服從二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)）dCdt=K2C2（1）將（1）積分CCo11+K2Cot=（2）一半單鏈DNA分子復(fù)性時(shí)，（2）式中的為121211+K2Cot=Cot1/2值越大，復(fù)性速度越慢CCo（3）1K2Cot1/2=第9頁,共65頁，2024年2月25日，星期天二、分子雜交將任何具有互補(bǔ)核苷酸順序的兩條單鏈核酸分子放入同一個(gè)反應(yīng)體系，兩條互補(bǔ)鏈可通過復(fù)性重新締合形成雙鏈，這一過程成為核酸分子雜交。第10頁,共65頁，2024年2月25日，星期天三、探針

（一）探針的種類

基因組DNA探針

cDNA探針

RNA探針寡核苷酸探針探針：是指帶有標(biāo)記物的、能與被檢測(cè)的核酸片段互補(bǔ)的一段已知核酸片段。第11頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）探針的制備方法制備方法：(1)DNA重組技術(shù)(2)PCR擴(kuò)增(3)化學(xué)合成第12頁,共65頁，2024年2月25日，星期天合成寡核苷酸探針注意原則(1)長度（50-300bp);(2)G:C對(duì)含量40%-60%；(3)探針內(nèi)避免互補(bǔ)；(4)避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)；(5)與非靶序列有70%以上同源性或連續(xù)8個(gè)以上堿基序列相同，最好不用。第13頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（三）標(biāo)記物

1.想標(biāo)記物應(yīng)具備的特性：

高度靈敏性不影響堿基配對(duì)的特異性不影響探針分子的主要理化性質(zhì)對(duì)酶促反應(yīng)活性無影響或影響不大檢測(cè)方法具有高度靈敏性和高度特異性第14頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2.標(biāo)記物種類

核素標(biāo)記物：32p、35s、3H

非核素標(biāo)記物半抗原：生物素、地高率配體：生物素是親和素的配體熒光素：異硫氰酸熒光素、羅丹明等化學(xué)發(fā)光探針：標(biāo)記物與某種底物反應(yīng)發(fā)光，如生物素?；膲A性磷酸酶可使發(fā)光底物發(fā)光

第15頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（四）標(biāo)記方法

體內(nèi)標(biāo)記法：將核素標(biāo)記的化合物作為合成代謝的底物，在細(xì)胞合成代謝時(shí)使核素?fù)饺氲叫潞铣傻暮怂岱肿又?，?H-胸苷可摻入到DNA中，3H-尿苷可摻入到RNA中

第16頁,共65頁，2024年2月25日，星期天體外標(biāo)記法：化學(xué)標(biāo)記法：標(biāo)記物分子上的活性基因與探針分子上的某些基因反應(yīng)，標(biāo)記物直接結(jié)合到探針分子上酶促標(biāo)記法：標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記核苷酸，然后利用酶促法將標(biāo)記的核苷酸摻入到探針上第17頁,共65頁，2024年2月25日，星期天酶促標(biāo)記法1.切口平移法（nicktranslation)1、利用DNaseI在DNA雙鏈上造成單鏈切口2、利用大腸桿菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5

末端逐步切除3、在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板依次將dNTP連接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記的核苷酸摻入到新的DNA鏈中第18頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2.隨機(jī)引物法

其原理是隨機(jī)引物能與各種單鏈DNA模板結(jié)合，作為合成新鏈的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA鏈，其核苷酸序列與模板DNA完全互補(bǔ)。另一單鏈DNA模板同樣合成一條新的完全互補(bǔ)的DNA鏈。合成時(shí)，帶放射性核素標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中第20頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共65頁，2024年2月25日，星期天隨機(jī)引物法所具有的優(yōu)點(diǎn)：1、能進(jìn)行雙鏈DNA、單鏈DNA或RNA探針的標(biāo)記2、操作簡單方便，避免因DNaseI處理濃度掌握不當(dāng)所帶來的一系列問題3、標(biāo)記活性高，標(biāo)記活性可達(dá)108cpm/μgDNA以上4、可直接在低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液中進(jìn)行標(biāo)記第22頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3.PCR標(biāo)記法：將標(biāo)記的核苷酸作為PCR反應(yīng)的底物，以待標(biāo)記的DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標(biāo)記的核苷酸摻入到新合成的DNA分子中第23頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第24頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

三、影響雜交的因素

1、探針分子的濃度和長度：濃度越大，復(fù)性速度越快分子越大，復(fù)性速度越慢單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加雙鏈探針，濃度控制在0.1~0.5μg,濃度過高影響雜交效率第25頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、溫度：（1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低20~25℃

（2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低

Tm值（3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5℃第26頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3、離子強(qiáng)度：（1）低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加（2）高濃度的鹽使堿基錯(cuò)配的雜交體更穩(wěn)定，當(dāng)進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時(shí)，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度

第27頁,共65頁，2024年2月25日，星期天4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定，當(dāng)待測(cè)核酸與探針同源性不高時(shí)，加50%甲酰胺溶液在35~42℃雜交（2）如待測(cè)核酸序列與探針同源性高時(shí)，則用水溶液在68℃雜交

第28頁,共65頁，2024年2月25日，星期天5、核酸分子的復(fù)雜性：（1）核酸的復(fù)雜性是指存在于反應(yīng)體系中不同順序的總長度（2）復(fù)性速率與反應(yīng)體系中核酸復(fù)雜性成反比（3）兩個(gè)DNA樣品濃度絕對(duì)一致時(shí)，變性后的相對(duì)雜交率取決于DNA的相對(duì)復(fù)雜性第29頁,共65頁，2024年2月25日，星期天6、非特異性雜交反應(yīng)：（1）雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附（2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉

第30頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

四、應(yīng)用1.檢測(cè)特定生物有機(jī)體之間是否存在親緣關(guān)系；2.用來揭示核酸片段中某一特定基因的存在與否、拷貝數(shù)及表達(dá)豐度。第31頁,共65頁，2024年2月25日，星期天按待測(cè)核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相雜交印跡雜交原位雜交液相雜交按照雜交分子特性分DNA-DNA雜交DNA-RNA雜交蛋白質(zhì)雜交第二節(jié)核酸分子雜交的方法第32頁,共65頁，2024年2月25日，星期天一、Southern印跡雜交此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。第33頁,共65頁，2024年2月25日，星期天帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡雜交的技術(shù)流程第34頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（一）待測(cè)核酸樣品的制備

1、裂解或破碎細(xì)胞

2、抽取純化基因組DNA3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段第35頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）待測(cè)DNA樣品的電泳分離

1、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠分離小片段用高濃度膠

2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子

DNA泳動(dòng)慢,小分子DNA泳動(dòng)快，大小相同的分子處于同一條帶

3、分子量標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)HindⅢ消化的λDNA，雜交所用分子量標(biāo)準(zhǔn)可用核素標(biāo)記

第36頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（三）凝膠中核酸的變性（堿變化）凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的單鏈DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液

第37頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（四）Southern印跡指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固相支持物上的過程第38頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1、固相支持物的選擇（1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性①具有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子的能力②不影響與探針的雜交反應(yīng)③與核酸分子結(jié)合穩(wěn)定牢固④具有良好的機(jī)械性能

非特異吸附少第39頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（2）常用的固相支持物①硝酸纖維素膜：優(yōu)點(diǎn)是吸附能力強(qiáng)，雜交信號(hào)本底低。缺點(diǎn)是DNA分子結(jié)合不牢固②尼龍膜：優(yōu)點(diǎn)是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸纖維素膜強(qiáng)；缺點(diǎn)：雜交信號(hào)本底高③化學(xué)活化膜：優(yōu)點(diǎn)：DNA與膜共價(jià)結(jié)合；對(duì)不同大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點(diǎn)：結(jié)合能力較上述兩種膜低第40頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、Southern印跡的常用方法（1）毛細(xì)管虹吸印跡法

利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動(dòng)作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運(yùn)動(dòng)，同時(shí)帶動(dòng)凝膠中的DNA片段垂直向上運(yùn)動(dòng)，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上第41頁,共65頁，2024年2月25日，星期天。第42頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（2）電轉(zhuǎn)法利用電場(chǎng)的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。第43頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（3）真空轉(zhuǎn)移法

此法原理與毛細(xì)管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個(gè)真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時(shí)帶動(dòng)核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。第45頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

（五）Southern雜交

1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點(diǎn)預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液

2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測(cè)DNA雜交雙鏈DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交

3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的

DNA

第47頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（六）雜交結(jié)果檢測(cè)

1、放射自顯影：適用于放射性核素標(biāo)記的探針

2、比色或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：適于非核素標(biāo)記的探針第48頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（七）Southern雜交在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

1、酶切圖譜分析

2、特定基因定性和定量

3、基因突變分析

4、限制性片段長度多態(tài)性的分析第49頁,共65頁，2024年2月25日，星期天二、Northern印跡雜交

1、基本原理和基本過程與Southernblot基本相同

2、鑒別RNA3、探針可用DNA或RNA片段

4、待測(cè)樣品為總RNA或mRNA第50頁,共65頁，2024年2月25日，星期天Northern印跡與Southern印跡的不同點(diǎn)

1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時(shí)加變性劑保持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳中不變性

2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern印跡時(shí)，DNA轉(zhuǎn)膜前需進(jìn)行堿變性及中和處理

3、靶核酸為RNA第51頁,共65頁，2024年2月25日，星期天三、Western印跡雜交

將待檢測(cè)蛋白質(zhì)（或酶）經(jīng)PAGE電泳并染色后，轉(zhuǎn)移到濾膜上固定，再用“抗體-抗原”免疫反應(yīng)或“DNA-protein”結(jié)合反應(yīng)鑒別濾膜上的蛋白質(zhì)。第52頁,共65頁，2024年2月25日，星期天四、斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交

1、斑點(diǎn)印跡為圓形

2、狹縫印跡為線狀

3、鑒別DNA、RNA4、簡單、快速，同一張膜可檢測(cè)多個(gè)樣品

5、特異性不高、不能鑒別核酸分子量第53頁,共65頁，2024年2月25日，星期天五、原位雜交1、定義：將標(biāo)記的核酸探針與固定在細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱原位雜交。根據(jù)檢測(cè)物分細(xì)胞內(nèi)原位雜交和組織切片內(nèi)原位雜交；根據(jù)探針與待檢核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA雜交；根據(jù)雜交物分為菌落、噬菌斑及真核細(xì)胞原位雜交。第54頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

保持組織細(xì)胞的形態(tài)對(duì)核酸無抽提，修飾與降解作用不改變核酸在組織細(xì)胞內(nèi)的定位不阻礙核酸與探針的雜交過程對(duì)雜交信號(hào)無遮蔽作用理化性質(zhì)穩(wěn)定2、雜交過程：（1）組織或細(xì)胞的固定理想固定液應(yīng)具備：第55頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（2）組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理

去垢劑（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶

K去除核酸表面的蛋白質(zhì)組織細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合成核酸蛋白復(fù)合體控制消化時(shí)間，避免細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和核酸從載玻片上脫落第56頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（3）探針的選擇與標(biāo)記

以獲得最好雜交效果為依據(jù)選擇探針探針的長度一般為50~300bp,有時(shí)達(dá)1.5kb

放射性核素標(biāo)記探針敏感性高，操作簡便穩(wěn)定檢測(cè)結(jié)果分辨率高，但信號(hào)檢測(cè)時(shí)間長非核素標(biāo)記探針安全、穩(wěn)定性好、顯色快，易于觀察第57頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（4）雜交

雜交液體積小：10~20μlcDNA和RNA探針雜交溫度約為50℃

雜交時(shí)間:DNA探針雜交為2~4h.RNA探針雜交過夜雜交前一般將組織切片置95℃5~15分鐘使DNA變性沖洗