人禽流感實(shí)驗(yàn)室檢測關(guān)鍵技術(shù)專項(xiàng)方案

附7禽流感試驗(yàn)室檢測技術(shù)方案一、試驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)設(shè)置試驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)由中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國家流感中心和省級流感試驗(yàn)室兩級組成。二、試驗(yàn)室條件及生物安全操作要求1．省級流感試驗(yàn)室試驗(yàn)條件及生物安全操作要求（1）試驗(yàn)生物安全要求：安全Ⅱ級+（BSL-2級+）或安全Ⅲ級（BSL-3級）。（2）特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測、血清學(xué)檢測中用到血凝抑制試驗(yàn)（HI）能夠在安全Ⅱ級+（BSL-2級+）試驗(yàn)室里操作。（3）特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測在安全Ⅱ級+（BSL-2級+）試驗(yàn)室生物安全柜里提取病毒核酸，進(jìn)行病毒核酸檢測試驗(yàn)室要求請參考國家相關(guān)核酸檢測要求要求。（4）微量中和試驗(yàn)、特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測陽性采樣標(biāo)本病毒分離、尸檢標(biāo)本檢測必需在安全Ⅲ級（BSL-3級）試驗(yàn)室里操作。（5）省級流感試驗(yàn)室試驗(yàn)條件：含有進(jìn)行禽流感相關(guān)臨床標(biāo)本初篩所需生物安全柜、離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、紫外線檢測儀等配套設(shè)備。2．國家流感中心試驗(yàn)生物安全要求：生物安全Ⅱ級+（BSL-2級+）和生物安全Ⅲ級（BSL-3級）試驗(yàn)室。3．省級流感試驗(yàn)室職責(zé)（1）禽流感標(biāo)本特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測；（2）禽流感H5血清學(xué)檢測工作;（3）特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測陽性標(biāo)本病毒分離必需在生物安全Ⅲ級（BSL-3級）試驗(yàn)室；（4）沒有生物安全Ⅲ級（BSL-3級）試驗(yàn)室，將標(biāo)本送國家流感中心做病毒分離工作。4．國家流感中心試驗(yàn)室職責(zé)（1）國家流感中心設(shè)置在中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感室；（2）對各省匯報禽流感疑似病例或確診病例進(jìn)行復(fù)核、確定；（3）對不含有禽流感病毒分離條件省份送檢標(biāo)本檢測、分離和確定；（4）對需要做微量中和試驗(yàn)血清標(biāo)本進(jìn)行微量中和試驗(yàn)；（5）對各省級試驗(yàn)室檢測人員培訓(xùn)；（6）對各省級流感試驗(yàn)室質(zhì)量控制。三、原始標(biāo)本采集1．標(biāo)本采集人員醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)生、護(hù)士或當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心專業(yè)人員負(fù)責(zé)標(biāo)本采集并填寫標(biāo)本記錄表，標(biāo)本采集人員根據(jù)《禽流感職業(yè)暴露人員防護(hù)指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)》做好個人防護(hù)。2．標(biāo)本采集種類和時限（1）采集標(biāo)本種類：疑似禽流感患者咽、鼻拭子或含漱液、血清和死亡病例尸檢肺組織、氣管分泌物。采集標(biāo)本時間：1）咽、鼻拭子或含漱液在發(fā)病頭3天采集；2）急性期血清在發(fā)病后7天內(nèi)采集，恢復(fù)期血清在發(fā)病后2-4周采集；3）尸檢標(biāo)本尸檢時采集。3．標(biāo)本運(yùn)輸：全部采集標(biāo)本應(yīng)在醫(yī)院采集時立即分裝，一式二份，其中一份單獨(dú)保留，以備復(fù)核。采集標(biāo)本若不能在二十四小時內(nèi)送達(dá)，則應(yīng)立即在－70℃以下保留。無－70℃條件需在－20℃冰箱短時間暫存，并立即聯(lián)絡(luò)遞送標(biāo)本。4．標(biāo)本采集方法：詳見國家標(biāo)準(zhǔn)《流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)》四、送流感中心標(biāo)本包裝、運(yùn)輸和接收1．標(biāo)本包裝（1）標(biāo)本必需放在大小適合帶螺旋蓋內(nèi)有橡膠圈塑料管里，擰緊。（2）將密閉后標(biāo)本放入大小適合塑料袋內(nèi)密封；每袋裝一份標(biāo)本。（3）直接在塑料管上用油性記號筆寫明樣本種類、采樣時間、編號、姓名，同時也將標(biāo)本相關(guān)信息填在禽流感人體標(biāo)本送檢記錄表，連同塑料管用另一塑料袋密封。（4）將裝標(biāo)本密封袋放入專用運(yùn)輸箱內(nèi)（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔軟物質(zhì)填充，內(nèi)襯具吸水和緩沖能力材料。同一患者2份以上密封標(biāo)本，能夠放在同一個塑料袋內(nèi)再次做密封。若將進(jìn)行病毒分離，可將密封好裝有標(biāo)本容器直接放入液氮運(yùn)輸罐內(nèi)運(yùn)輸。全部容器必需印有生物危險標(biāo)識。2．標(biāo)本運(yùn)輸（1）航空或鐵路運(yùn)輸。（2）專員專車運(yùn)輸：關(guān)鍵用于近距離樣品運(yùn)輸。3．標(biāo)本接收（1）各省級中心試驗(yàn)室應(yīng)公布標(biāo)本接收聯(lián)絡(luò)方法，并實(shí)施二十四小時標(biāo)本接收制；（2）國家試驗(yàn)室標(biāo)本接收：需送國家流感中心試驗(yàn)室檢測原始標(biāo)本、病毒分離物、可疑陽性標(biāo)本、血清等，填寫標(biāo)本送檢記錄表，在低溫保留條件下，于二十四小時內(nèi)送至中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所流感中心進(jìn)行復(fù)核。國家流感中心標(biāo)本接收聯(lián)絡(luò)方法為：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，地址：北京市宣武區(qū)迎新街100號，聯(lián)絡(luò)人：郭元吉、王敏，聯(lián)絡(luò)電話：，，傳真：（010）63534632。五、標(biāo)本檢測方法1．禽H5病毒核酸檢測：材料：疑似禽流感患者咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例尸檢肺組織、氣管分泌物等。方法：RT-PCR，用于禽H5亞型流感病毒快速檢測、測序及排除工作試劑：特異性H5及甲型流感病毒引物、病毒RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶等試劑,提議使用德國QIAGENRneasyMiniKit(病毒核酸提取)和QIAquickGelExtractionKit（PCR產(chǎn)物純化）產(chǎn)品。2．病毒分離及判定：材料:疑似禽流感患者咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例尸檢肺組織、氣管分泌物等。方法：采取雞胚和MDCK細(xì)胞分離方法，血凝及血凝抑制試驗(yàn)（HAI）具體方法詳見國家標(biāo)準(zhǔn)《流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)》。經(jīng)特異性H5RT-PCR病毒核酸檢測陽性標(biāo)本病毒分離及判定工作必需在安全Ⅲ級（BSL-3級）試驗(yàn)室里操作。試劑：雞胚接種采取SPF雞胚，MDCK細(xì)胞等。3．疑似病例血清學(xué)檢測：材料：疑似病例急性期和恢復(fù)期雙份血清方法：血凝抑制試驗(yàn)具體方法詳見國家標(biāo)準(zhǔn)《流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)》。試劑：H5滅活病毒。4．微量中和試驗(yàn)材料：疑似病例急性期和恢復(fù)期雙份血清試劑：H5活病毒，必需在生物安全Ⅲ級(BSL-3級)試驗(yàn)室里操作。六、檢測結(jié)果確實(shí)定以下情況原始標(biāo)本及分離物送國家流感中心檢測、復(fù)核、確定。1．標(biāo)本分離物血凝試驗(yàn)（HA）陽性，同時H5血凝抑制試驗(yàn)（HI）陰性，H5RT-PCR檢測陽性。2．標(biāo)本分離物血凝試驗(yàn)（HA）陽性，同時H5血凝抑制試驗(yàn)（HI）陽性或H5RT-PCR檢測陽性。3．標(biāo)本分離物血凝試驗(yàn)（HA）陽性，同時H5RT-PCR檢測陽性。4．病人恢復(fù)期血清比急性期血清H5抗體有4倍或以上增高。5．標(biāo)本分離物血凝試驗(yàn)（HA）陽性，H5血凝抑制試驗(yàn)陰性，并已排除了是目前流行甲、乙型毒株可能。七、檢測結(jié)果匯報通常情況下,試驗(yàn)室收到樣本立即進(jìn)行試驗(yàn)，并于收到標(biāo)本后二十四小時內(nèi)出具RT-PCR檢測匯報，3-5天出具病毒分離培養(yǎng)結(jié)果，于分離到病毒后3-5天出具流感病毒血凝抑制結(jié)果，微量中和試驗(yàn)須3-5天完成。當(dāng)試驗(yàn)過程中出現(xiàn)不可估計(jì)情況或意外事件，影響了按時出具匯報時，應(yīng)立即匯報和說明。附件ICSGB中國國家標(biāo)準(zhǔn)GB流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza(報批稿)公布實(shí)施國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局公布目次序言――――――――――――――――――――――――――――――――31范圍―――――――――――――――――――――――――――――――42診療標(biāo)準(zhǔn)―――――――――――――――――――――――――――――43診療標(biāo)準(zhǔn)―――――――――――――――――――――――――――――44處理標(biāo)準(zhǔn)―――――――――――――――――――――――――――――5附錄A（規(guī)范附錄）病原學(xué)診療方法―――――――――――――――――5附錄B（規(guī)范附錄）血清學(xué)診療方法―――――――――――――――――7附錄C（資料附錄）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)―――――――――――――――8附錄D（資料附錄）神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)――――――――――――――12附錄E（資料附錄）對流免疫電泳及瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)―――――――――16附錄F（資料附錄）流感快速診療方法――――――――――――――――19GB前言流行性感冒(簡稱流感)為一個人、禽、畜共患病毒性急性傳染病。流感病毒依據(jù)其核蛋白（NP）和M1蛋白抗原性和基因特征不一樣分為甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出現(xiàn)，能引發(fā)世界性流感大流行，它在動物中廣泛分布，并也能在動物中引發(fā)流感流行和造成大量動物死亡。乙型流感病毒能引發(fā)流感局部暴發(fā)，不會造成世界性流感大流行，至今除在人以外還能在海豹中分離到它。丙型流感病毒關(guān)鍵以散在形式出現(xiàn)，關(guān)鍵侵襲嬰幼兒，通常不引發(fā)流感流行，它也能感染豬。流感常忽然發(fā)生，快速蔓延，波及面廣，發(fā)病率和死亡率均高但病死率低。至今仍嚴(yán)重威脅著人身心健康，甚至奪走性命，常給國民經(jīng)濟(jì)帶來巨大損失，中國被世界公認(rèn)為是流感多發(fā)地。受衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室委托，由郭元吉同志負(fù)責(zé)對流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)GB15944-1995進(jìn)行修改，其目標(biāo)：把過時，不適用刪除，加入適用新內(nèi)容。具體修改之處以下：序言中強(qiáng)調(diào)了流感為一個人、禽、畜共患病，同時考慮到禽流感病毒在人群中可引發(fā)流感，其傳輸路徑不清楚，故把傳輸路徑刪除。診療標(biāo)準(zhǔn)中增加了或從患者采集標(biāo)本中查到病毒顆粒特異蛋白或特異核酸成份。試驗(yàn)室診療中去掉白細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)，因該指標(biāo)不能做為流感試驗(yàn)診療依據(jù)。附錄A。病毒分離中，因甲型流感病毒“O”相特征出現(xiàn)，故強(qiáng)調(diào)了細(xì)胞系統(tǒng)分離病毒關(guān)鍵性；在HA測定中不應(yīng)用雞紅細(xì)胞，而應(yīng)用豚鼠或人紅細(xì)胞。把B3神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)改為附錄D。把B3中不規(guī)范一律改為當(dāng)今國際上統(tǒng)一使用方法。刪除B2已過時，操作復(fù)雜，易受試驗(yàn)條件影響“型特異性補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，改為附錄E“對流免疫電泳”，同時考慮到對禽血清抗體測定時，常見瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)。所以，在附錄E中也加入后者內(nèi)容。快速診療為附錄C改為附錄F。同時加入FLUOIAKit和RT-PCR法。本標(biāo)準(zhǔn)附錄A和B是規(guī)范附錄。本標(biāo)準(zhǔn)附錄C-F是資料附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由中國衛(wèi)生部提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所本標(biāo)準(zhǔn)關(guān)鍵修訂人：郭元吉本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部傳染病防治監(jiān)督管理辦公室負(fù)責(zé)解釋。中國國家標(biāo)準(zhǔn)流行性感冒診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)GBDiagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza范圍本標(biāo)準(zhǔn)要求了流感診療標(biāo)準(zhǔn)及處理標(biāo)準(zhǔn)。本標(biāo)準(zhǔn)適適用于各級醫(yī)療、衛(wèi)生、保健機(jī)構(gòu)和人員。對流感診療，匯報和處理應(yīng)用。診療標(biāo)準(zhǔn)流感流行時通?？梢罁?jù)臨床癥狀，結(jié)合流行病學(xué)資料可對患者作出初步診療。如確診則需要病毒分離陽性或病人雙份血清抗體測定，其恢復(fù)期抗體滴度較急性期增高4倍或以上，或從患者采集標(biāo)本中查到病毒粒特異蛋白或特異核酸成份。3診療標(biāo)準(zhǔn)3．1流行病學(xué)資料在流行季節(jié)一個單位或地域同時出現(xiàn)大量上呼吸道感染病人；或近期內(nèi)當(dāng)?shù)赜蚧蜞徑赜蛏虾粑栏腥静∪孙@著增多；或醫(yī)院門診呼吸道感染病人顯著增多；或挨家挨戶上呼吸道感染患者顯著增多。3．2臨床癥狀3．2．1出現(xiàn)急起畏寒、高熱、頭痛、頭暈、滿身酸痛、乏力等中毒癥狀。3．2．2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等癥狀。3．2．3少數(shù)病例有食欲減退、伴有腹痛，腹脹、嘔吐和腹瀉等消化道癥狀。3．3試驗(yàn)室診療3．3．1從病人鼻咽分泌物中可分離到流感病毒（見附錄A）。3．3．2患者恢復(fù)期血清中抗流感病毒抗體滴度比急性期高4倍或以上（見附錄B）。3．3．3在患者呼吸道上皮細(xì)胞查到流感病毒顆粒特異蛋白成份或特異核酸（見附錄F）。3．3．4采集標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞將病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特異蛋白或特異核酸（見附錄F）。4病例分類3．4．1疑似病例（流感樣病例）含有腋下體溫≥38℃，加上其它臨床癥狀兩項(xiàng)或以上，或加3、1及胃腸道癥狀兩項(xiàng)或以上。3．4．2確診病例疑似病例加3.3.1或3.3.2或3.3.3或3.3.4。處理標(biāo)準(zhǔn)4.1早期隔離病人,服抗流感病毒藥品,對癥診療和防并發(fā)癥.早期發(fā)覺病人,早期隔離(因地制宜,就地合適隔離)病人是關(guān)鍵方法.對病人診療通常采取對癥療法,發(fā)病早期(48小時內(nèi))可服用抗流感病毒藥品,嚴(yán)重患者如嚴(yán)重肺炎,呼吸極度困難,高熱不退等需住院診療.防治并發(fā)癥關(guān)鍵應(yīng)預(yù)防流感病毒性肺炎和細(xì)菌性肺炎,尤其對年邁體衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或嬰幼兒等流感高危人群因她們因?yàn)榱鞲斜旧砘蚱渌喜Y可造成死亡,故應(yīng)尤其注意加強(qiáng)診療護(hù)理.2預(yù)防方法通常采取綜合性方法，講究衛(wèi)生，注意體格鍛煉和營養(yǎng)，保持室內(nèi)空氣流通；對易感人群應(yīng)采取相對隔離方法，如避免接觸病人，不去公共場所等；對年邁和健康狀態(tài)差，尤其帶有慢性病人必需時可采取滅活疫苗接種，對疫苗過敏者或可能已被感染（如親密接觸病人）者應(yīng)立即服用抗流感病毒藥品。附錄A（規(guī)范附錄）病原學(xué)診療方法A1病毒分離從疑似流感病人呼吸道采集標(biāo)本分離病原體．A2標(biāo)本采集病毒分離成功是否很大程度上取決于采集標(biāo)本質(zhì)量，時間（應(yīng)于發(fā)病頭3天，越早越好），及其保留運(yùn)輸?shù)炔襟E。標(biāo)本關(guān)鍵取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時也采取肺活檢材料等。常見采樣液為：一般肉湯，pH7.4-7.6Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。在采樣液中需加入抗菌素，以往多用青、鏈霉素，最近發(fā)覺不少種類細(xì)菌對它們含有耐藥性，故最近多用慶大霉素（其終濃度為每ml采樣液中加入0.1ml10mg/ml）和抗真菌素（終濃度為每ml采樣液中加入0.008ml250ug/ml）。A2．1標(biāo)本采集方法A2．2．1鼻拭子將棉簽輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處，停留片刻后緩慢轉(zhuǎn)動退出。以同一拭子拭兩側(cè)鼻孔。將棉簽浸入4-5ml采樣液管中，尾部棄去。然后，塞緊或蓋好管蓋。A2．2．2咽拭子用棉簽擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，一樣將棉簽頭浸入4-5ml采樣液管中，尾部棄去，塞緊或蓋好管蓋。注：亦可將鼻、咽拭子搜集于同一采樣管中，方便提升分離率，降低工作量。A2．2．3鼻咽抽取物或抽取氣管和支氣管分泌物用和負(fù)壓泵相連搜集器從鼻咽部抽取粘液或從 氣管抽取氣管和支氣管分泌物。先將搜集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)搜集器頭部并緩慢退出。搜集抽取粘液，并用采樣液涮洗搜集器3次。最近中國有用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替換搜集器。A2．2．4漱口液用10ml采樣液漱口。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)噢聲，讓洗液在咽部轉(zhuǎn)動。然后，用平皿或燒杯搜集漱液。注：取漱口液時，需預(yù)先了解患者是否對抗菌素有過敏史，如有，含漱液中不應(yīng)含抗菌素。A2．2．5肺活檢材料肺活檢組織在無菌條件下，用滅菌過乳缽磨碎，用生理鹽水配成20%懸液，rpm離心10min，取上清加入上述提到抗菌素。A3標(biāo)本運(yùn)輸標(biāo)本應(yīng)在≤4℃條件下，立即送至試驗(yàn)室。標(biāo)本至試驗(yàn)室后，病毒分離標(biāo)本應(yīng)立即進(jìn)行接種分離，48h內(nèi)能進(jìn)行接種可置4℃保留，如未能接種應(yīng)置≤-70℃下保留。A4標(biāo)本處理標(biāo)本至試驗(yàn)室后，含棉拭子標(biāo)本，先將棉拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出。然后用潔凈滅過菌毛細(xì)吸管反復(fù)吹打搜集溶液，方便打壞粘液。置4℃待其自然沉淀5-10min。注：如采樣液中還未加抗菌素應(yīng)補(bǔ)加之，所加量同前，加完并混勻，置4℃1-2h后方可用于接種。A5接種和培養(yǎng)最常見為細(xì)胞接種和雞胚接種法，有條件應(yīng)兩法并用。最近因?yàn)椤癘”相毒株出現(xiàn)，MDCK（MadinDardyCanineKidney）等部分細(xì)胞對“O”相毒株敏感性大大超出雞胚敏感性。同時“O”相毒株幾乎不凝集雞紅細(xì)胞，故最近在紅細(xì)胞凝集和凝集抑制試驗(yàn)中常見豚鼠或人“O”型紅細(xì)胞，而不用雞紅細(xì)胞。A5．1MDCK細(xì)胞接種和收獲成片MDCK細(xì)胞棄生長液，用Hanks氏液洗兩遍，將殘余牛血清洗凈，每瓶加入接種標(biāo)本0.5-1.0ml，（接種量要依據(jù)瓶大?。?，通常2瓶/標(biāo)本，輕晃細(xì)胞瓶，使標(biāo)本完全覆蓋細(xì)胞，置35℃吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3ml（隨瓶大小而異）維持液（不含小牛血清，而含終濃度為2ug/ml胰酶Eagle氏溶液），置35℃培養(yǎng)；次日起天天觀察有沒有細(xì)胞病理改變（CPE）；當(dāng)CPE出現(xiàn)+++～++++號時，即75%-100%細(xì)胞出現(xiàn)病變時進(jìn)行收獲，收獲之前可將細(xì)胞凍融1-2次以提升收獲標(biāo)本病毒滴度。因?yàn)镃PE不能證實(shí)就是流感病毒所造成。最終還需檢驗(yàn)維持液中是否有紅細(xì)胞凝集活性（HA），用毛細(xì)吸管取細(xì)胞維持液3-4滴，放入血凝板孔中，以后加入等容量1%豚鼠或人紅細(xì)胞，輕搖混勻，置室溫或4℃，1h后觀察結(jié)果。出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集為陽性標(biāo)本，收獲全部維持液進(jìn)行病毒判定。如收獲維持液HA滴度不高或量不夠用于判定，需在MDCK細(xì)胞中傳代，把HA滴度提升或量增加后，方可進(jìn)行病毒判定。如HA陰性，應(yīng)在MDCK細(xì)胞上盲傳一代，如HA仍陰性，可認(rèn)為是陰性標(biāo)本，棄之。注：CPE出現(xiàn)時間隨感染病毒型別，甚至毒株差異和感染量大小而異。通常標(biāo)本接種后7-10天還不出CPE，維持液中又查不出HA活性，基礎(chǔ)上可認(rèn)為陰性標(biāo)本，棄之。同時要注意MDCK細(xì)胞代數(shù)，因隨MDCK細(xì)胞代數(shù)增加，其對流感病毒敏感性下降。A5．2雞胚接種和收獲取9-11日胚齡雞胚，經(jīng)羊膜腔和尿囊腔接種標(biāo)本0.2ml，每份標(biāo)本接種3-4只胚，置33-35℃培養(yǎng)72h。然后將雞胚置4℃過夜（或置-20℃冰箱1h再置4℃數(shù)小時），分別收獲尿囊液和羊水并檢驗(yàn)HA活性（用毛細(xì)吸管分別取3-4滴尿囊液和羊水，分別置大孔塑料板不一樣孔內(nèi)，再加入3-4滴1%豚鼠或人紅細(xì)胞，搖勻后置室溫或4℃1h后觀察結(jié)果。如HA為+++～++++時，再按系列倍比稀釋測定HA滴度，如含有一定HA滴度即可進(jìn)行病毒判定。如HA陰性，可盲傳一代，如HA仍為陰性則棄之。A6病毒判定至今對流感病毒判定最常見方法為紅細(xì)胞凝集抑制（HI）測定，因該法簡便易行，結(jié)果可信（具體方法見附錄C）。其次為神經(jīng)氨酸酶活性抑制（NI）測定（具體方法見附錄D）。進(jìn)行型判定時常見對流免疫電泳（具體方法見附錄E）。附錄B（規(guī)范附錄）血清學(xué)診療方法B1血清標(biāo)本采集血清標(biāo)本應(yīng)包含急性期和恢復(fù)期雙份血清。急性期血樣應(yīng)盡早采集，通常不晚于發(fā)病后7天。恢復(fù)期血樣則在發(fā)病后2-4周采集。單份血清通常不能用作診療。血液標(biāo)本-2500rpm離心15min。搜集血清，棄血凝塊。B2血清標(biāo)本運(yùn)輸和保留血清標(biāo)本在4℃下運(yùn)輸，置≤-20℃下長久保留。B3抗體測定測定用抗原通常為目前人群中流行H3N2和H1N1亞型及乙型流感病毒。測定方法為HI法（見附錄C）。B4結(jié)果判定凡恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期增高≥4倍為陽性結(jié)果，其它均為陰性結(jié)果。附錄C（資料附錄）紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)C1原理流感病毒粒表面血凝素（HA）蛋白，含有識別和結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體結(jié)構(gòu)，能夠和部分哺乳類動物和禽紅細(xì)胞發(fā)生凝集，這就是紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。即使多個哺乳動物和禽類紅細(xì)胞均能被流感病毒凝集，但現(xiàn)在應(yīng)用最廣是豚鼠、雞和人“O”型紅細(xì)胞?！癘”相毒株是指只能在雞胚羊膜腔或敏感細(xì)胞中生長，感染羊水或細(xì)胞維持液只凝集人或豚鼠紅細(xì)胞，而幾乎不凝集雞紅細(xì)胞流感毒株。這種毒株在雞胚尿囊腔適應(yīng)傳代后，取得了在雞胚尿囊腔復(fù)制能力，同時還取得了對雞紅細(xì)胞凝集能力和人及豚鼠一樣好，這種生物學(xué)特征發(fā)生改變病毒為“D”相毒株。流感病毒能從凝集紅細(xì)胞表面釋放下來，釋放下來病毒還能凝集新紅細(xì)胞，而被凝集和釋放后紅細(xì)胞不能再被相同病毒顆粒所凝集。于病毒懸液中加入特異性抗流感病毒HA蛋白抗血清，能抑制紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象出現(xiàn)，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)?，F(xiàn)在，紅細(xì)胞凝集和凝集抑制試驗(yàn)為流感各方面工作中應(yīng)用最廣泛一個技術(shù)。C2試驗(yàn)器材C2．1大孔或小孔塑料板C2．210ml或1ml或1000ul和200ul或多排吸管C2．3200ul和1000ul吸頭C3試劑C3．10.85%無菌生理鹽水C3．2Alsever氏液葡萄糖2.08g檸檬酸鈉0.80g檸檬酸0.055gNaCl0.42g加蒸餾水至100ml8磅20分鐘高壓滅菌，置4℃?zhèn)溆?。C3．31%紅細(xì)胞懸液以雞紅細(xì)胞為例：于10或20ml注射器中先吸入約3ml阿氏液（Alsever'sSolution），然后從雞翅靜脈或心臟采集，用生理鹽水洗滌3次，前2次1500r/min離心5min，最終1次同速度離心10min，棄上清，用無菌生理鹽水配成1%懸液，置4℃待用。通常置4℃能保留7天左右，一旦發(fā)生溶血應(yīng)棄掉。C3．4受體破壞酶（RDE）C3．5免疫血清或測定血清C4紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)C4．1操作步驟C4．1．1取一潔凈大孔塑料板，標(biāo)識所要測定標(biāo)本名稱C4．1．2于第一孔加入0.25ml（1：2開始稀釋）或0.4ml（1：5開始稀釋），從第二孔開始一律各加0.25ml0.85%生理鹽水。C4．1．3如1：2開始稀釋，于第一孔中加入0.25ml病毒懸液；如1：5開始稀釋，于第一孔中加入0.1ml病毒懸液。用吸管吹打，使充足混勻，吸出0.25ml至第二孔，依次類推作倍比稀釋，直至最終一孔，吹打后吸出0.25ml棄掉。C4．1．4于每孔中加入0.25ml生理鹽水，然后再加入0.25ml1%紅細(xì)胞懸液。相混后置室溫或4℃30-60min，以后觀察結(jié)果。注：如采取微量法，應(yīng)用小孔塑料板和稀釋槍，總量為75ul（病毒25ul，25ul生理鹽水和紅細(xì)胞懸液25ul），其它同常量法。C4．2觀察結(jié)果結(jié)果以++++、+++、++、+、±和—表示之。一層紅細(xì)胞均勻地鋪于孔上者為++++。基礎(chǔ)同上，但邊緣不整齊，鋪面積稍小些者為+++。紅細(xì)胞形成一個環(huán)狀，四面有小凝集塊者為++。紅細(xì)胞形成一個小團(tuán)，但邊緣不光滑，四面有小凝塊者為+。紅細(xì)胞于孔底形成一個小團(tuán)，邊緣光滑并有立體感，將板傾斜片刻，就可見紅細(xì)胞滑動象人眼淚滴樣者為—。但用豚鼠或人“O”型紅細(xì)胞時常見不到孔底形成一個小團(tuán)和眼淚滴樣結(jié)果出現(xiàn)。“±”即為可疑，計(jì)算時以“—”（陰性）處理。C4．3紅細(xì)胞凝集滴度計(jì)算結(jié)果以++為終點(diǎn)，亦即一個凝集單位。也就是說最高稀釋度病毒能引發(fā)++號紅細(xì)胞凝集為終點(diǎn)，此稀釋度倒數(shù)為紅細(xì)胞凝集滴度，簡稱血凝滴度。下面以表1為例，進(jìn)行計(jì)算。表１紅細(xì)胞凝集單位計(jì)算標(biāo)本號病毒稀釋度滴度備注1:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801++++++++++++++++++++++++——480取均數(shù)2+++++++++++++++++++++++++—560小1/83++++++++++++++++++++++++++—640無須算4+++++++++++++++++++++++++++—800大1/45++++++++++++++++++++++++++—640先整后算6++++++++++++++++++++++++++++++++>1280或≥19207————————<10或≤7.5口訣：先整后算。表1中，1-4，6和7無須進(jìn)行整理，而5中，必需將1：640處一個加號挪到1：320處為4個加號，而1：160處變成兩個加號，然后再進(jìn)行計(jì)算。兩個加號不用算。如表1中3，滴度為640。小，小本身1/8。如表1中2，1：640處僅一個加號，故血凝滴度一定小于640，應(yīng)為640-640/8=560。大，大本身1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，應(yīng)為640+640/4=800。兩個極端取中間。如1，1：320為4個加號，1：640為陰性，應(yīng)為（320+640）/2=480。C5紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)C5．1操作步驟C5．1．1血清中非特異抑制素去除受體破壞酶（RDE）處理法：1容量血清，加4容量RDE，37℃水浴16~18h，然后，置56℃水浴50min(以破壞殘余RDE活性)；置4℃保留待用，勿凍存。經(jīng)此法處理人、雞和山羊血清對甲、乙型流感病毒非特異性抑制素均可完全去除。RDE處理對特異性抗體無影響。但有時經(jīng)處理血清對測定紅細(xì)胞有非特異性凝集。如發(fā)覺時應(yīng)在處理后血清中加入終濃度為20%濃測定用紅細(xì)胞，搖勻，置室溫60min或4℃過夜，1000r/min離心5min，收存上清。對人血清抗體測定時，通常均經(jīng)此步處理。C5．1．2四個血凝單位抗原制備四個血凝單位計(jì)算：將血凝單位除以4，如表1中標(biāo)本1，它四個血凝單位應(yīng)為：480/4=120，立即標(biāo)本1進(jìn)行1：120稀釋時，其稀釋液就是含四個血凝單位。配成后必需進(jìn)行復(fù)核測定：取一塊潔凈大孔塑料板，在前三孔，也可任意連續(xù)三孔，每孔加入0.25ml生理鹽水，用一根1ml吸管，取0.25ml四個血凝單位抗原放入第一孔，倍比稀釋至第三孔，吸出0.25ml棄之，然后每孔加入0.25ml生理鹽水，再加入0.25ml1%紅細(xì)胞懸液，搖勻，置室溫30—60min后，觀察結(jié)果。正確結(jié)果，應(yīng)第一孔出現(xiàn)++++，第二孔++，第三孔陰性或+。如太大或太小全部得重新配置。復(fù)核測定合格后，置4℃或冰上，當(dāng)日使用。C5．1．3血抑測定C5．1．3．1取一潔凈塑料板，標(biāo)明測定血清標(biāo)本，最終一孔為血清對照孔。C5．1．3．2每孔加入0.25ml生理鹽水。C5．1．3．3于第一孔和最終一孔中各加入0.25ml經(jīng)RDE處理過血清，從第一孔起作倍比稀釋至倒數(shù)第二孔，棄掉0.25ml。C5．1．3．4將最終一孔輕輕吹打后，亦棄掉0.25ml。C5．1．3．5于最終一孔加入0.25ml生理鹽水，其它各孔一律加入0.25ml四個凝集單位抗原，輕輕搖勻，置室溫60min。C5．1．3．6各孔加入0.25ml1%紅細(xì)胞懸液，搖勻置室溫30-60min后觀察結(jié)果。C5．1．3．7對照組血清對照血清0.25ml+生理鹽水0.25ml血凝素對照分別加入4，2，1，1/2單位血凝素0.25ml+生理鹽水0..25ml紅細(xì)胞對照加生理鹽水0.5ml以上各對照組再分別加入1%紅細(xì)胞懸液0.25ml，搖勻，在相同條件下觀察結(jié)果。C5．2結(jié)果判定血凝統(tǒng)計(jì)同血凝測定法，以能完全抑制紅細(xì)胞凝集（簡稱血抑）最高血清稀釋度倒數(shù)為血清抗體效價，即終點(diǎn)。以表2為例，加以說明。表2血抑測定結(jié)果血清號血清稀釋度效價1：101：201：401：801：1601：3201：6401：12801——————++++++++3202—————+++++++++2803—————++++++++++2404—————+++++++++++2005—————++++++++++++1606—————++++++++3207————————≥12808++++++++++++++++++++++++++++++++<10或≤5一樣在計(jì)算抗體效價之前，應(yīng)對結(jié)果進(jìn)行整理，方法同前。如6中，必需把1：320處一個加號移到1：640處，使1：320處變成“—”，而1：640處變成“++++”。依據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算：X=Y+Y/4×ZX：血清效價Y：能引發(fā)血凝全抑制最高血清稀釋度倒數(shù)Z：4減去不能被抑制數(shù)（全抑制高一個稀釋度）比如：2號血清效價：X=Y+Y/4×Z=160+160/4×（4-1）=280C5．3交叉血抑測定和抗原比計(jì)算為了確切了解抗原性變異幅度，常見交叉血抑測定進(jìn)行抗原分析。測定中所用免疫血清包含既往流行過代表株和用新分離病毒制備免疫血清。所用抗原全部是和血清對應(yīng)同株抗原。每個抗原均必需正確調(diào)至四個單位，試驗(yàn)必需在同一條件下進(jìn)行。依據(jù)公式計(jì)算抗原比：R=√r1·r2r1=甲血清對乙抗原血抑滴度/甲血清對甲抗原血抑滴度r2=乙血清對甲抗原血抑滴度/乙血清對乙抗原血抑滴度R為抗原比，當(dāng)R=1時，表明兩株間抗原性相同；R<1.5/1或1/<1.5時，表明兩毒株間抗原性無顯著差異；R為1/1.5—1/2時表明兩毒株抗原性有小差異，R值越大，差異越大。附錄D（資料附錄）神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)D1反應(yīng)原理：D1．1自由N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminicacid）經(jīng)神經(jīng)氨酸酶作用，自胎球蛋白（Fetuin）底物中釋放。D1．2經(jīng)過碘酸鹽氧化作用，將N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)化為?-甲酰丙酮酸（β-formylpyruvicacid）。D1．3?-甲酰丙酮酸經(jīng)硫代巴比妥酸作用形成生色團(tuán)。D1．4用有機(jī)溶劑提取生色團(tuán)，便可用分光光度計(jì)測定之，這么可測知標(biāo)本中神經(jīng)氨酸酶活性，并可選擇用于神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)劑量。神經(jīng)氨酸酶活性抑制試驗(yàn)是測定血清抑制標(biāo)準(zhǔn)量酶活性效價。NI測定已成為流感病毒判定不可缺乏手段之一。因NI測定結(jié)果是流感病毒神經(jīng)氨酸亞型劃分關(guān)鍵依據(jù)之一。有時該法也用于了解流感病毒NA抗原性變異和血清診療等方面。NI測定不受血清中非特異性抑制素影響，但易受病毒粒血凝素抗體影響即空間干擾。為處理這弊端，在流感病毒判定中，常使用單價血清（只針對NA）或基因重配毒株所制備免疫血清（如使基因重配株NA抗原為N2或N1，其HA抗原為馬1（H7）亞型）。D2材料D2．1試劑配制D2．1．1磷酸緩沖液甲液：400mmol/L正磷酸氫二鈉乙液：400mmol/L正磷酸二氫鈉丙液：60mmol/L氯化鈣甲液19ml加乙液81ml混之，將pH調(diào)至5.9±0.05，pH偏高用乙液調(diào)之，偏低用甲液調(diào)之。以后加入1ml丙液，此時CaCl2終濃度為6mmol/L。置4℃或室溫保留。注：常常加入CaCl2后，緩沖液出現(xiàn)沉淀，故我們通常不加它。甲、乙液為200mmol/L。D2．1．2胎球蛋白用蒸餾水把冰凍干燥胎球蛋白配制成48-50mg/ml溶液（讓其緩慢溶解）?；?qū)⒈鶅霰Ａ籼デ虻鞍兹芤河萌ルx子水配成工作液。D2．1．3過碘酸鹽試劑4．28g過碘酸鈉(NaIO4)溶于38ml去離子水中，加62ml濃正磷酸，充足混合，存于帶玻璃塞棕色瓶中。D2．1．4砷試劑10g亞砷酸鈉（NaAsO4）和7.1g無水硫酸鈉加去離子水至100ml，混之，加0.3ml濃硫酸，使之完全溶解。D2．1．5硫代巴比妥酸試劑1.2g硫代巴比妥酸和14.2g無水硫酸鈉加入去離子水至200ml，在沸水浴中加熱溶解，用前新配，使用期為一周。D2．1．6生理鹽水0.85gNaCl加入100ml去離子水，溶解，置室溫保留。D2．1．7酸化正丁醇試劑95ml正丁醇（Butanol）中加入5ml濃鹽酸，存在帶塞棕色瓶中置室溫保留。D2．1．8玻璃器材和煮鍋等。D3操作步驟D3．1神經(jīng)氨酸酶活性測定D3．1．1病毒溶液用生理鹽水作倍比稀釋，通常新鮮尿囊液抗原作1：2—1：32稀釋已足夠。稀釋好病毒，每個稀釋度加一管，0.05ml/管。于底物對照管中加入0.05ml生理鹽水(不加病毒)。D3．1．2于每管中加入0.05mlpH5.9PBS(因流感病毒神經(jīng)氨酸酶最適pH為5.9),每管中再加入0.1ml胎蛋白溶液,充足混合后置37℃水浴16-18h。注:加每樣試劑均應(yīng)送至管底;我們稀釋病毒有時直接用200mmol/LpH5.9PBS,每管加0.1ml,這么做不正規(guī),但操作方便，對測定結(jié)果影響不大;有些流感病毒株NA活性很高，于37℃水浴2-4h(和底物一起)就可測出酶活性.D3．1．3從水浴中取出試管，放室溫冷卻，每管加入0.1ml過碘酸鹽試劑，充足混合，置室溫20min（這個時間要正確）。D3．1．4每管緩慢加入1ml砷試劑。因?yàn)榈忉尫懦霈F(xiàn)棕色，搖蕩試管待棕色消失乳白色出現(xiàn)為止。必需時試驗(yàn)可在此步暫停，測定物置4℃冰箱保留。其它測定步驟一律不能暫停）。D3．1．5每管加入2.5ml硫代巴比妥酸試劑，充足混合。該試劑在煮沸溶解時趁熱加入管中。D3．1．6立即將試管置煮沸水浴中煮15min，此時所出現(xiàn)紅色即為神經(jīng)氨酸酶活性反應(yīng)。D3．1．7將試管置冰水中冷卻，然后加入4ml酸化正丁醇，塞上潔凈膠皮塞，用手猛烈搖蕩1-2min，使紅色轉(zhuǎn)到丁醇層。D3．1．81500r/min離心5min,上層達(dá)成透明不混濁。D3．1．9將分光光度計(jì)波長調(diào)至549nm，用底物對照管調(diào)零點(diǎn)，以后，從高稀釋度到低稀釋度，將管中上層溶液吸置透光池中，依次測出并統(tǒng)計(jì)它們吸光度A值（曾稱光密度OD值），A值越高表明酶活性越強(qiáng)。D3．1．10一個酶單位確定：通常將A值為0.45-0.85病毒稀釋度作為一個酶單位。我們常將A值為0.5病毒稀釋度為一個酶單位，用于酶活性抑制測定。一個酶單位確定方法以下：將上述測到數(shù)據(jù)作直線回歸，找出A值為0.5病毒稀釋度。但也能夠下方法來確定：取一張半對數(shù)坐標(biāo)紙，其縱軸（對數(shù)）表示病毒稀釋度，橫軸（算術(shù)）表示吸光度。于吸光度值為0.5處畫一條和縱軸平行直線。將所得A值一一標(biāo)在對應(yīng)位置上，見圖1示意圖。在吸光值0.5周圍找出4個點(diǎn)，其中2個點(diǎn)A值大于0.5，而另2個點(diǎn)小于0.5。在這4個點(diǎn)中找出一條直線，這條直線要使它一側(cè)點(diǎn)至其垂直線平均值和另一側(cè)點(diǎn)到其垂直線平均值相等。這條線和0.5垂直線有一個交叉點(diǎn)（圖中X點(diǎn)）。從X點(diǎn)向縱軸線劃一條和橫坐標(biāo)相平行線（圖中虛線），這條線和縱坐標(biāo)相交點(diǎn)為Y。Y點(diǎn)所表示數(shù)字如8，也就是說當(dāng)測定病毒1：8稀釋時就相當(dāng)于一個酶單位。注：因?yàn)椴《九卸〞r多為定性，通常做到步驟6（D3.1.6）已足夠，接著可憑經(jīng)驗(yàn)判定病毒所用濃度；有些流感病毒株酶活性很低，經(jīng)延長和底物孵育時間后仍很低，對這些毒株進(jìn)行酶判定時，需靈活掌握，通常肉眼見到有一定紅色（吸光度肯定小于0.5）也就能夠了。D3．2神經(jīng)氨酸酶活性抑制測定D3．2．1測定血清作0.5Lg稀釋（一個0.5Lg稀釋為1：3.16，它近似值為1：3.2）。具體稀釋法舉例圖2。稀釋好血清從高稀釋度到低稀釋度各取出0.05ml于標(biāo)好對應(yīng)稀釋度空管中.按同法做正常血清對照組。D3．2．2將已測定抗原用生理鹽水配成一個酶單位，加入測定血清和對照血清中，0.05ml/管。相混，37℃水浴孵育1h。D3．2．3從水浴中取出試管，每管加入0.1ml胎球蛋白溶液，混合，置37℃水浴16-18h。D3．2．4從水浴取出，接著步驟同酶測定步驟3-9（D3.1.3-D3.1.9）。但吸上層溶液于透光池中，應(yīng)從低稀釋度血清到高稀釋度血清。D3．2．5計(jì)算血清對神經(jīng)氨酸酶活性抑制效價：依據(jù)測定血清和正常血清兩組測定結(jié)果，求每組血清同一稀釋度A值商數(shù)，即為經(jīng)血清作用后所剩酶活性百分?jǐn)?shù)。具體計(jì)算公式以下：每一稀釋度（如1：10）血清+病毒A值X100%=%酶活性同一稀釋度（1：10）正常血清+病毒A值D3．2．6血清效價是能抑制50%酶活性最高血清稀釋度倒數(shù)。它確實(shí)定方法以下：取一張半對數(shù)坐標(biāo)紙，縱坐標(biāo)（對數(shù)）表示血清稀釋度，橫坐標(biāo)（算術(shù)）表示剩下神經(jīng)氨酸酶活性百分?jǐn)?shù)。將“5”步驟（D3.2.5）所得數(shù)放在坐標(biāo)紙上應(yīng)在位置。圖3。（3）從酶活性剩下50%處劃一條和縱坐標(biāo)平行直線，在50%酶活性處找出3-4個點(diǎn)，使其中1-2個點(diǎn)剩下酶活性不到50%，而其它1-2個點(diǎn)剩下酶活性大于50%，在這3-4個點(diǎn)間畫一條直線，一樣使這條直線一側(cè)1-2點(diǎn)至直線垂直線平均值和另一側(cè)垂直線平均值相等。（4）從這條線和50%線相交處（途中x）向縱坐標(biāo)劃一條和橫坐標(biāo)相平行線。這條線和縱坐標(biāo)相交叉（y）處所表示數(shù)字即為血清效價。如y處為1400，則該血清神經(jīng)氨酸酶抑制效價為1：1400。當(dāng)然也可用直線回歸來計(jì)算。注：對流感病毒株判定時，我們對陽性血清常見200mmol/LpH5.9PBS進(jìn)行倍比稀釋，通常從1：10開始，用量0.1ml/管，這么加上0.1ml抗原在加0.1ml底物，這時總量為0.3ml/管，和標(biāo)準(zhǔn)0.2ml/管有出入，但對定性測定影響不大；正常對照血清用不一樣亞型或不一樣型免疫血清替換；結(jié)果常見肉眼判定，不測A值；至于血凝素抗體空間干擾問題，通常情況不加以重視，因它干擾程度約為10%，我們所用免疫血清血抑效價多為1：640左右，這么當(dāng)NI效價≥40時可判為陽性，通常就不受空間干擾影響了；當(dāng)然對關(guān)鍵關(guān)鍵毒株判定時，需用單價抗血清進(jìn)行判定；在磷酸緩沖液中需加入終濃度為1‰NaN3；Russ等人曾報道用三硝基甲苯X-100（TritonX-100），Yamane等人報道用多聚仙梨醇（NonidetP40）直接處理完整病毒粒，就能排除空間干擾，依據(jù)我們實(shí)踐，這些方法效果不穩(wěn)定。附錄E（資料附錄）對流免疫電泳及瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)E1對流免疫電泳（Counter-Immunoelectrophoresis）E1．1原理帶電顆粒向著和它相反電荷電極移動，稱為“電泳”。膠體顆粒因?yàn)榻怆x或吸附而使表面帶電荷，在電場中便發(fā)生移動。比如蛋白質(zhì)因?yàn)橛斜┞对诒砻鏄O化基團(tuán)，如-COO-基和NH3+，在酸性溶液里-COO-基和H+結(jié)合，生成不解離-COOH，結(jié)果蛋白質(zhì)分子表面NH3+基過剩，使它帶有正電荷；反之，在堿性溶液里，-OH-和-NH3+基作用生成H2O和不帶電荷-NH2基，結(jié)果，分子因-COO-基過剩而帶負(fù)電荷。反應(yīng)式以下：NH3+NH3+在酸性條件下：蛋白質(zhì)+H+蛋白質(zhì)COO-COOHNH3+NH2在堿性條件下：蛋白質(zhì)+OH-蛋白質(zhì)+H2OCOO-COO-在某一特定pH時，蛋白質(zhì)分子凈電荷為零，這時pH為該蛋白等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)pH溶液中，蛋白質(zhì)分子既不向正極也不向負(fù)極移動。依據(jù)膠體此種特征，給一個高于或低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)pH溶液，在一定電場影響下會使顆粒向一極移動。在pH8.6瓊脂凝膠中，抗體球蛋白只帶有微弱負(fù)電荷，它分子較大，電泳慢，受電滲作用影響，電泳時向負(fù)極倒退?？乖鞍子休^強(qiáng)負(fù)電荷，分子較小，泳動快，在電滲作用下，即使減慢了泳動速度，但仍向正極泳動。如將抗體置正極，抗原置負(fù)極，電泳時，抗體和抗原相對泳動，一定時間后在兩極之間相遇，在合適地方就形成肉眼可見沉淀線。E1．2關(guān)鍵材料E1．2．1甲、乙型流感病毒NP抗原和對應(yīng)抗血清。E1．2．2pH8.6巴比妥緩沖液9g巴比妥納加0.5gNaN3,用去離子水配至1000ml,以后用鹽酸將pH調(diào)至8.6。E1．2．31.5%瓊脂糖1.5g瓊脂糖加50mlpH8.6巴比妥緩沖液,用去離子水補(bǔ)至100ml,相混,溶解。E1．2．4玻璃板或特制電泳框架。將溶化瓊脂糖倒在玻璃板或框架上，瓊脂厚度為2-3mm。E1．2．5染色液5g考馬斯亮蘭溶于100ml去離子水中。但通常不需要染色。E1．3操作步驟E1．3．1待瓊脂糖凝固堅(jiān)固后，打數(shù)排小孔，橫縱向孔距均為6mm，孔直徑為4mm。E1．3．2放電泳液把打好孔板放入電泳槽中，然后放入電泳液（pH8.6巴比妥緩沖液）。但電泳液不能把瓊脂淹沒。E1．3．3搭橋玻璃板兩頭（正、負(fù)極）用一般濾紙搭成橋，使電泳時電流從瓊脂糖通用。E1．3．4加樣AAAOOOAAAOOO未ABOOOBBBOOO未ABOOO抗體抗原抗體抗原A為甲型流感病毒；B為乙型流感病毒；“未”為測定未知抗原E1．3．5電泳通常見低壓輸出，2mA/cm，電泳1-2h。E1．3．6結(jié)果觀察首先觀察對照樣本。A和A，B和B孔間應(yīng)見清楚一條白色沉淀線，A和B及B和A孔間見不到白色沉淀線；假如測定抗原和A抗體孔間出現(xiàn)一條白色沉淀線，就判定測定抗原為甲型流感病毒；假如測定抗原和B抗體間出現(xiàn)一條白色沉淀線，則斷定測定抗原為乙型流感病毒。注：有時電泳后，沉淀線不夠清楚，可將瓊脂板泡在生理鹽水中2-4h；也可將鹽水泡過瓊脂板放入考馬斯亮蘭溶液中染1h，取出再泡在鹽水中，這么能提升沉淀線清楚度。用鹽水浸泡過沉淀線為白色，而經(jīng)考馬斯亮蘭染色過沉淀線為蘭色。經(jīng)染色后仍見不到沉淀線，可判定測定抗原既不是甲型，也不是乙型流感病毒。E2瓊脂凝膠沉淀試驗(yàn)瓊脂凝膠沉淀（AgarGelPrecipitation，AGP）試驗(yàn)是依據(jù)在瓊脂介質(zhì)中抗原和抗體同時向著相互方向移動所形成沉淀線。全部流感病毒核殼蛋白（NP）和基質(zhì)蛋白（MP）抗原性均含有型特異性。AGP試驗(yàn)就是用來測定上述兩種抗體或抗原。而目前關(guān)鍵用于禽血清中抗體測定。當(dāng)今已發(fā)覺甲型流感病毒，其血凝素有15個亞型，神經(jīng)氨酸酶有9個亞型，它們均能在禽中找到，假如用HI或NI法（含有亞型特異）進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，幾乎不可能，因工作量很大。眾所周知，禽流感實(shí)際上為一個人、禽、畜共患病，禽中流感動態(tài)已越來越被大家所重視。以往認(rèn)為禽血清抗體用瓊脂凝膠沉淀測定時，不易出現(xiàn)沉淀線。最近發(fā)覺，如在高鹽條件下，可出現(xiàn)清楚沉淀線。E2．1安全操作酚時戴上手套和面罩，用過裝置和電極用冷水沖洗；假如接觸到酚，立即洗手，接觸部位立即用冷水沖洗。E2．2試驗(yàn)材料E2．2．1瓊脂擴(kuò)散板配制：氯化鈉80g酚5g去離子水1000ml瓊脂12.5g先用去離子水將酚和氯化鈉溶解，用1NNAOH將pH調(diào)至7.5，然后加入瓊脂，煮沸溶解。可按每玻璃瓶20ml量進(jìn)行分裝，置室溫冷卻，凝固，以后置4℃保留。用時，再煮沸溶解，倒入陪替氏培養(yǎng)皿，讓其凝固。配制時，可依據(jù)需要量按上述配方配之。E2．2．2病毒濃縮含病毒雞胚尿囊液或細(xì)胞維持液↓1000xg離心15min，去沉渣↓100000xg離心1h，去上清↓濃縮時，通常雞胚尿囊液用500ul，細(xì)胞上清為700ul。此時在沉淀物中加入350ulTSE溶液，把沉淀物吹勻，搜集到1.5ml沉淀管中。注：病毒濃縮也可用常規(guī)超速離心，甚至可加以純化，用時可參考上述百分比，如500ul尿囊液變?yōu)?50ul。E2．2．3TSE溶液配制Tris2.42gNaCl8.77gEDTA0.74g去離子H2O900ml溶解后用1NHCl將pH調(diào)至7.8，然后用去離子水補(bǔ)至1000ml，消毒或超濾除菌，至4℃保留，待用。E2．3試驗(yàn)步驟E2．3．1用模具和打孔器，在已凝固瓊脂上打孔，孔徑為5mm，孔距為2-5mm。E2．3．2每孔加入約50ul測定血清，同時需有陽性和陰性血清對照孔。E2．3．3將加樣后瓊脂板放入盒中，封好，置室溫下孵育，盒中放一小塊濕棉花或濕濾紙，保持濕度。E2．3．4結(jié)果觀察24-48h后，觀察沉淀線，沉淀線清楚度取決于抗原和抗體濃度。沉淀線最好在黑背景下進(jìn)行觀察，而光線是在黑背景后面射出。特異陽性結(jié)果，陽性血清和抗原及測定血清和抗原間呈連續(xù)沉淀線。如出現(xiàn)交叉沉淀線，表明測定血清缺乏和陽性血清一致抗體。如陽性血清和陽性抗原不出現(xiàn)沉淀線或陰性對照抗血清和陽性抗原出現(xiàn)和陽性對照孔一樣沉淀線，表明試驗(yàn)需重做。附錄F（資料附錄）流感快速診療方法用酶免疫測定來直接查甲型和乙型流感病毒。下列兩種方法通常在15-20分鐘內(nèi)就可觀察結(jié)果。F1DirectigenFluAKit快速診療甲型流感病毒。測定第一步采集標(biāo)本用含溶解細(xì)胞去污劑和粘液溶解劑提取溶液處理。稀釋標(biāo)本使之成均質(zhì)，然后，加到濾膜上。病毒抗原結(jié)合到膜上。下一步，洗掉非結(jié)合物，同時加入兔IgG來阻斷膜被以后加入試劑非特異性結(jié)合。加入酶標(biāo)識抗流感病毒特異單抗，反復(fù)洗滌后，和兩種底物溶液孵育，經(jīng)過測定結(jié)合酶活性來作判定。病毒抗原存在時，在膜上就可見到一個紫色三角形。病毒抗原在膜中央一個小圓區(qū)域內(nèi)作為試驗(yàn)對照。在試劑盒中含有陽性和陰性對照材料。F1．1試驗(yàn)材料F1．1．1DirectigenFluAKitBectonDickinson，Cat#8560-20F1．1．2測定標(biāo)本F1．1．3甲型流感病毒參考抗原F1．2試驗(yàn)步驟將加樣控制器嵌入檢測板分別將125ul待檢樣品或DMEM-S細(xì)胞培養(yǎng)液加入兩個加液管每個加液管內(nèi)加8滴（約0.4ml）試劑A以提取抗原于加液管上加滴頭后充足混合樣品將加液管內(nèi)全部混合物逐滴加入檢測板中央檢測孔（每個加液器內(nèi)樣品加一個檢測板，注意避免氣泡）快速滴加試劑1，直至加滴檢測孔（沖洗）待所以液體被吸附后去掉檢測板上加樣控制器加4滴試劑2（封閉吸附膜以防抗體非特異性吸附）待全部液體被吸附后加4滴試劑3（酶聯(lián)抗體）待全部液體被吸附后置室溫2min快速滴加試劑4，直至加滴檢測孔（沖洗）待全部液體被吸附后加4滴試劑5（沖洗）待全部液體被吸附后加4滴試劑6（底物1）孔內(nèi)出現(xiàn)淡黃色加4滴試劑7（底物2）置室溫5-30min加4滴試劑8終止反應(yīng)（檸檬酸）F1．3結(jié)果分析陽性：檢測板中央可見一紫紅色三角型。陰性：檢測板中央可見一紫紅色圓點(diǎn)。不詳：檢測板中央既無紫紅三角型又無紫紅色圓點(diǎn)，試驗(yàn)需反復(fù)。F1．4對照濾器中央病毒抗原斑點(diǎn)作為試驗(yàn)對照。假如試驗(yàn)完成不出現(xiàn)任何斑點(diǎn)，表明不是濾器軟片就是有試劑過期了。在試劑盒中含有陽性和陰性對照材料。病毒陽性和陰性標(biāo)本可存在-20℃條件下，用做以后測定對照。F1．5不足標(biāo)本質(zhì)量嚴(yán)重影響著測試敏感性。當(dāng)用試驗(yàn)室生長病毒，其測定水平在無細(xì)胞條件下為1000至蝕斑形成單位（PFU）或大約20個受感細(xì)胞。所以，采樣時必需搜集足夠量上皮細(xì)胞，陰性結(jié)果不能完全排除患者得過甲型流感病毒感染可能性。所以，陰性只可認(rèn)為測不出甲型流感病毒。假如粘液沒有效溶解或從標(biāo)本中去除掉，它能阻礙病毒抗原附著在膜上。這么就會造成假陰性結(jié)果。這些標(biāo)本只能經(jīng)過很慢地吸附到膜來加以判定或把它們深入1：4稀釋后進(jìn)行重測定。在試劑盒中所含試劑和濾器裝置全部有不一樣使用期，用時需檢驗(yàn)一下它們是否已過期。F2FLUOIAKIT快速診療甲、乙型流感病毒FLUOIA測定包含甲、乙型流感病毒NP蛋白提取和測定。這個光學(xué)免疫測定技術(shù)是經(jīng)過分子薄膜光學(xué)厚度物理改變用肉眼直接觀察。這種改變是因?yàn)榭乖涂贵w結(jié)合到硅晶片光學(xué)表面所造成。當(dāng)提取抗原直接放入光學(xué)表面，固定在光學(xué)表面上特異抗體就會捕捉抗原。洗滌后，加入底物就會增加分子薄膜厚度。這種厚度改變就造成了反射光線方向改變。同時肉眼所見到為一個顏色改變。光學(xué)厚度改變造成一個特殊可見顏色改變。在金黃色背景下出現(xiàn)紫光斑點(diǎn)為陽性結(jié)果。假如標(biāo)本中不含有抗原，就不會被固定抗體所捕捉。所以，光學(xué)厚度維持不變，表面維持原來金黃色，表明是陰性結(jié)果。F2．1試驗(yàn)材料F2．1．1FLUOIAKit。Biostar，Cat#FLU30F2．1．2待檢樣品F2．1．3甲、乙型流感病毒參考毒株F2．2試驗(yàn)步驟從冰箱中取出試劑應(yīng)置室溫使之溫度變至18℃-30℃。試劑盒打開后，洗液置室溫保留，假如儲存冰箱，用時洗液最少置室溫2h?！谔崛」苤屑尤?滴標(biāo)本稀釋液和2滴試劑2。↓患者標(biāo)本拭子立即加入提取管。讓拭子和溶液充足相混，方便讓液體移至纖維管頂部。最少停留3min但不超出5min?！?dāng)再加入一滴試劑2時，扶著拭子柄讓其在提取管倒面。然后，用拭子讓其和試劑充足相混。讓拭子在管壁不停地擠壓，盡可能擰干，讓液體越多越好，最終拭子棄之。↓用潔凈吸管吸一滴提取標(biāo)本直接置測試表面中心。最少停留6min，但不超出7min?！孟匆撼渥阆礈鞙y試表面，但千萬要小心，不能將吸附在測試表面材料全部洗掉。↓檢驗(yàn)并核實(shí)在測定裝置蓋子上吸水紙是否是在第一部位置上。關(guān)緊測試裝置，停留10sec來去除測試表面殘余濕氣。↓打開蓋，把吸水紙置第二部位置上，在測試表面中央加入一滴底物。最少停留6min，但不超出7min?！?0sec，打開并檢驗(yàn)顏色改變。F2．3結(jié)果判定F2．3．1純蘭色/沿著中央對照點(diǎn)出現(xiàn)強(qiáng)紫色反應(yīng)圈為陽性結(jié)果。F2．3．2不出現(xiàn)任何反應(yīng)圈，只見中央對照點(diǎn)者為陰性結(jié)果。F2．3．3假如中央對照不出現(xiàn)，全部試驗(yàn)作廢，需反復(fù)測定。F2．4對照每次測定必需設(shè)抗原對照，測定時在測定表面中央出現(xiàn)一個小蘭點(diǎn)/紫色斑點(diǎn)。滅活乙型流感病毒抗原對照用來調(diào)試試劑。無抗原對照試驗(yàn)結(jié)果是不可靠。另外陽性和陰性對照也是必需。陽性對照抗原為滅活甲型流感病毒。陰性對照抗原為一個蛋白溶液。F2．5不足結(jié)果好壞取決于標(biāo)本采集質(zhì)量，已滅活病毒也可進(jìn)行測定；陰性結(jié)果不能完全排除其它非流感病毒感染；陰性結(jié)果也不能完全排除患者曾得過流感感染，所以，只能解釋為查不到甲型或乙型流感病毒；糞便標(biāo)本不能進(jìn)行測定。F3直接檢驗(yàn)呼吸道脫落上皮細(xì)胞內(nèi)病毒特異抗原F3．1原理流感病毒關(guān)鍵感染部位是在呼吸道上皮細(xì)胞，所以在病人呼吸道標(biāo)本脫落細(xì)胞中含有流感病毒抗原和核酸，經(jīng)過直接檢驗(yàn)上皮細(xì)胞內(nèi)病毒特異抗原或核酸即可診療。檢驗(yàn)方法可采取免疫熒光法查病毒抗原，通常于3-4h內(nèi)即可完成，采取RT-PCR法查病毒核酸24h內(nèi)也可完成。F3．2標(biāo)本采集和制片標(biāo)本采集最好用負(fù)壓抽取法搜集呼吸道分泌物，尤其脫落細(xì)胞?？蓪⒚繕?biāo)本分成兩份，一份低溫凍存?zhèn)渥鞑《痉蛛x等。另一份用pH7.2PBS將粘液吹打散，1500rpm離心15min，棄上清，細(xì)胞沉淀用PBS洗1-2次，末次離心后棄上清，加入適量pH7.2PBS使細(xì)胞垂懸，滴加于帶圈玻璃片上，室溫干燥，以后冷丙酮固定10min。F3．3間接免疫熒光法F3．3．1用10%新鮮羊或牛血清封閉標(biāo)本片，置濕盒中于37℃30min。F3．3．2分別加入合適稀釋度抗甲型和乙型流感病毒型特異單克隆抗體，置濕盒中于37℃1h。在PBS中洗兩次，共10min。F3．3．3加合適稀釋度兔抗鼠熒光素結(jié)合物，置37℃1h。在PBS中洗三次，共10min，末次用蒸餾水洗一下。F3．3．4于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。觀察到三個以上胞漿內(nèi)或胞核內(nèi)熒光陽性即可判為陽性。注：也可將采集標(biāo)本進(jìn)行核酸提取，然后經(jīng)RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，能特異擴(kuò)增出為陽性，不能特異擴(kuò)增出為陰性。F4標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖后查病毒抗原F4．1原理采集標(biāo)本接種敏感細(xì)胞過夜增殖后，將細(xì)胞消化分散制成抗原片，再用免疫熒光法或免疫酶染法檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)病毒抗原，也可用RT-PCR對病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增和測定。標(biāo)本經(jīng)敏感細(xì)胞增殖后查病毒抗原或核酸，雖需第二天方可得出試驗(yàn)結(jié)果，但可大大提升檢測敏感性。F4．2標(biāo)本采集同A2。F4．3標(biāo)本接種培養(yǎng)及制片。標(biāo)本接種見A5．1，置35℃過夜培育后，倒掉維持液，用消化液（1份0.25%胰酶+4份Versene）將細(xì)胞消化下來。用PBS洗一次，然后滴加于帶圈玻璃片上，室溫干燥，冷丙酮固定。同法制備未經(jīng)感染正常MDCK細(xì)胞片即為正常對照細(xì)胞。F4．4間接免疫熒光法見F3．3。F4．5間接免疫酶染法F4．5．1加單克隆抗體同F(xiàn)3．3．2。F4．6間接免疫酶染法F4．6．1加單克隆抗體同F(xiàn)3．3．2。F4．6．2加合適稀釋度羊抗鼠酶標(biāo)結(jié)合物，濕盒中置37℃1h，用PBS洗兩次10min。F4．6．3加鄰苯二胺底物溶液，其配制法為：4mg鄰苯二胺+10mlpH5.0磷酸—檸檬酸緩沖液+15ulH2O2。pH5.0磷酸緩沖液配制法為：先分別配制0.1mol/L檸檬酸和0.1mol/L磷酸氫二鈉，然而，分別按24.3ml和25.7ml相混，再加入等容量（50ml）去離子水，混勻即為pH5.0磷酸—檸檬酸緩沖液。加入底物液3-5min即可觀察結(jié)果。F4．6．4結(jié)果觀察于倒置顯微鏡下觀察（觀察時細(xì)胞要濕，假如細(xì)胞已干，能夠加入一滴自來水）。觀察到棕紅色深染細(xì)胞，依據(jù)觀察到此細(xì)胞多少，統(tǒng)計(jì)為++++，+++，++，+，±，—。以觀察到一個加號以上深染細(xì)胞判為陽性；有時可觀察到單個深染細(xì)胞被無色或淡紅色細(xì)胞所包圍，而正常細(xì)胞呈無色或淡紅色，亦可判為陽性。F5逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）對流感診療和流感病毒株判定RT-PCR為一個很有用技術(shù)，它能測出很低水平流感病毒基因組。不管病毒是活還是死均可進(jìn)行測定，所以RT-PCR技術(shù)，不管在流感診療，還是監(jiān)測和研究中均得到廣泛應(yīng)用。如1997年中國香港特區(qū)從患者中分離到H5N1毒株，為證實(shí)分離可靠性就曾用該法對儲存在冰箱中標(biāo)本進(jìn)行測定。又如最近歐美國家為深入揭開19世界性流感大流行毒株之謎。將死于那次流感長久凍埋在白嶺海峽尸體挖出，取出肺，然后用RT-PCR法進(jìn)行測定，取得了驚人結(jié)果。要想使該法含有敏感性和特異性，引物序列選擇最為關(guān)鍵，其次要設(shè)試驗(yàn)對照，嚴(yán)防試驗(yàn)室交叉污染。即使，至今甲型流感病毒已發(fā)覺血凝素（HA）有15個亞型，神經(jīng)氨酸酶（NA）有9個亞型，但很多流感病毒基因組序列已搞清。這給特異引物設(shè)計(jì)提供了可能，同時還發(fā)覺全部流感病毒各個RNA節(jié)段，其5’和3’末端均具保守性，可依據(jù)此特征來合成流感病毒通用引物（Universalprimer）。目前在人群中同時流行甲型流感病毒有H3N2和H1N1兩亞型毒株和乙型流感病毒。1997年和1998年還發(fā)覺H5N1和H9N2亞型毒株也能感染人，最近有些人推測H6亞型毒株也有可能能感染人。即使，流感病毒在人群中能常常、連續(xù)不停地發(fā)生基因突變，有時需更換引物方可提升敏感性和特異性，但現(xiàn)在這已輕易辦到。同時流感病毒編碼M和NP基因含有型特異性，而且是保守，合成引物可長久加以使用。以下以判定H5、H6和H9亞型流感為例來加以說明。F5．1從病毒分離標(biāo)本中提取RNAF5．1．1QiagenRNAeasyTMTotalRNAIsolationKit（Catalog#74104）：RNeasyminispincolumns（RNeasy小旋轉(zhuǎn)圓柱）Collectiontubes1.5ml（1.5ml搜集管）Collectiontubes2ml（2ml搜集管）BufferRLT（RLT緩沖液）BufferRW1（RW1緩沖液）BufferRPE（RPE緩沖液）RNase-freewaterRNA（無RNA酶水）F5．1．2β-mercaptoethanol（β-巰基乙醇）F5．1．370%ethanol（70%乙醇）F5．1．4Sterile1.5mlmicrocentrifugetubes（消毒過1.5ml離心管）F5．1．510、20and100uladjustablepipettesandtips（10、20和100ul可調(diào)加樣器和滴頭）F5．1．6Microcentrifuge，adjustableto13K（可調(diào)連至13K微型離心機(jī)）F5．1．7Vortex（旋轉(zhuǎn)混合器）F5．2試驗(yàn)步驟F5．2．1把下列材料混合在一起350ul溶解RLT緩沖液3.5ulβ-巰基乙醇200ul病毒懸液550ul70%乙醇F5．2．2用加樣器將上述混合物吸入圓柱中（粉紅色），10000rpm離心15sec。F5．2．3取出圓柱，將搜集管底部液體倒光，再將圓柱放回搜集管上。F5．2．4向圓柱加入700ulRW1洗滌液，10000rpm離心15sec。F5．2．5將圓柱轉(zhuǎn)至一根潔凈搜集管中，向圓柱加入500ulRPE洗滌緩沖液。F5．2．610000rpm離心15sec，取出圓柱，把搜集管液體倒凈。F5．2．7向圓柱加入500ulRPE洗滌液，1rpm離心2min。F5．2．8將圓柱轉(zhuǎn)至一根消毒過潔凈1.5ml微離心管，將20ul無RNA酶水加到圓柱管濾膜上，停留1min。F5．2．910000rpm離心1min，搜集標(biāo)本用來做cDNA合成。也可置-20℃保留待用。F5．3cDNA合成F5．3．1材料·消毒過0.5ml微型離心管·10、20和100ul可調(diào)加樣器和滴頭·可調(diào)至13K微型離心機(jī)·旋轉(zhuǎn)混合器·PCR擴(kuò)增儀·提取病毒RNA·10mM雙脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）混合物·超純水·引物“Uni12”：AGCAAAAGCAGG（1ug/ul）·AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（25單位/ul，LifeSciences，Inc，Cat#ARB-45）·5X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液·RNA酶抑制劑（40單位/ul）F5．3．2試驗(yàn)步驟F5．3．2．1全部需要試劑均放冰上。F5．3．2．2標(biāo)一支0.5ml離心管放RNA。F5．3．2．3陰性對照管用水替換RNA。F5．3．2．4試驗(yàn)管加入4ulRNA，對照管加入4ul水，然后各加入0.5ul引物“Uni-12”。F5．3．2．5置72℃5min。此時按以下百分比制備所需混合液：·1.5ulH2O·2.0ul逆轉(zhuǎn)錄緩沖液·0.5ul10mMdNTP混合物·0.5ulRNA酶抑制劑（RNasin）·1.0ul逆轉(zhuǎn)錄酶，混之F5．3．2．6