形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)二 石蠟切片法

形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二

石蠟切片法

（取材與固定）

生物體大部分是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察，必須采用特殊的方法對其進(jìn)行處理，才能觀察其內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

切片法：根據(jù)對組織包埋介質(zhì)不同分為石蠟切片法、火棉膠切片法、冰凍切片法等。

非切片法：包括整體制片法、涂布法、壓片法、磨片法、解離法等。

石蠟切片法在研究細(xì)胞、組織、胚胎以及形態(tài)等方面是最為理想的制片方法。廣泛用于醫(yī)院、醫(yī)科院校、生物醫(yī)學(xué)研究機(jī)構(gòu)、農(nóng)科、畜牧獸醫(yī)等動(dòng)植物組織研究，尤其在病理學(xué)方面是診斷疾病的重要工具之一。石蠟切片的主要步驟：一、取材二、固定三、洗滌四、脫水五、透明六、透蠟與包埋七、切片八、貼片九、染色十、封藏一、實(shí)驗(yàn)原理：

1、取材

材料的選擇是制作切片的第一步。用于制片的動(dòng)、植物材料應(yīng)選擇新鮮的，用陳腐的材料制片往往不能反映材料的真正情況。2、固定:

就是借助某類化學(xué)藥品的作用,使細(xì)胞組織的形態(tài)保存下來,不使其改變形態(tài)和變質(zhì)的過程。目的是有利于增加細(xì)胞內(nèi)含物的折光程度，增加媒染作用或染色能力；同時(shí)可使材料適當(dāng)變硬，并具有一定的堅(jiān)硬性便于切片。二、實(shí)驗(yàn)程序1．取材的方法根據(jù)取材的需要，用鋒利的單面刀片切取材料（動(dòng)物組織有規(guī)則的四方體1.0×1.0×0.5cm3，動(dòng)物的腸道、植物的根、莖、葉等組織取0.3～0.5cm長一小段）。取材要點(diǎn)：取材動(dòng)作要迅速，以免組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；根據(jù)需要選擇部位取材，盡可能避免損傷；切取病理材料時(shí)，連同正常組織也須切一部分，以便比較觀察。2．固定的方法根據(jù)材料的種類、大小、性質(zhì)與固定液的種類、性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱來確定固定時(shí)間，可以從幾小時(shí)到幾十小時(shí)，甚至數(shù)天。如將已切的小鼠肝組織快速放入10%的福爾馬林溶液中固定12～24時(shí)即可。固定劑一般為組織塊體積的10～15倍。固定材料時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)：一般固定液以新配為好，置陰涼處，以防失效；有些混合固定液會(huì)發(fā)生氧化還原作用，一定要現(xiàn)配現(xiàn)用；固定時(shí)間必須充分，對于水分較多的材料，中間應(yīng)更換1～2次新鮮固定液；如標(biāo)本塊多時(shí)，固定時(shí)不應(yīng)重疊；不要先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿，形成固定不均勻之弊。固定材料的容器應(yīng)注明固定液、材料來源、日期、操作者簽名等，以免與其他材料混淆。任何固定液對人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。

三、常用固定液的種類（一）單一固定液1、酒精（C2H5OH）：無色液體，可與水任意比例混合，是一種還原劑，不可隨意與重鉻酸鉀、鉻酸、鋨酸等混合。酒精滲透力很強(qiáng)，易引起組織收縮，固定用的適宜濃度一般為70％。2、甲醛（HCHO）：無色氣體，易揮發(fā)，具有強(qiáng)烈的刺激性氣味，37～40％的水溶液稱為福爾馬林。甲醛也是一種強(qiáng)的還原劑，不可與鉻酸、重鉻酸鉀、四氧化鋨等氧化劑混合。穿透力雖不如酒精，但不會(huì)象酒精那樣引起組織強(qiáng)烈收縮，兩者混合使用效果更好。常用于固定和保存標(biāo)本的福爾馬林濃度為5～10％。3、醋酸（冰醋酸，CH3COOH）4、苦味酸（三硝基苯酚，C6H2(NO2)3OH）5、重鉻酸鉀(K2Cr207)6、鉻酸（三氧化鉻水溶液，H2CrO4）7、四氧化鋨（鋨酸，OsO4）8、氯化汞（升汞或二氯化汞，HgCL2）

（二）混合固定液1、卡諾（Carrnoy）氏固定液2、FAA固定液（醋酸－酒精－福爾馬林混合液）3、波恩（Bouin）氏固定液4、秦克（Zenker）氏固定液5、納瓦興（Nawashin）氏固定液四、實(shí)驗(yàn)步驟1、動(dòng)物取材：分為活體直接取材、麻醉后取材、處死后取材。無論采取那種處死方法，多應(yīng)避免由于痛苦引起掙扎，而造成組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時(shí)取樣必須迅速，越快越好。因?yàn)閯?dòng)物一旦死亡，細(xì)胞便開始自溶。2、取材位置：每二人一組分別取KM小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、心臟、胃、肌肉組織中的兩種，

切成1.0×1.0×0.5cm3的四方體，快速放入10～15倍的10%的福爾馬林溶液中固定12～24時(shí)。要求每種組織至少取2～3塊。取胃腸時(shí)應(yīng)將其內(nèi)容物用蒸餾水沖洗干凈。1-23-45-67-89-0心臟脾臟肝臟腎臟大腦肺臟肌肉胃腸肝臟五、實(shí)驗(yàn)用品：器材：解剖盤、解剖剪、眼科剪、眼科鑷、止血鉗、手術(shù)刀片、離心管（帶蓋）、標(biāo)簽紙、記號筆等。試劑：10％福爾馬林固定液。材料：KM小鼠。頸椎脫臼法處死小鼠固定小鼠頸部↙頸椎脫臼法處死小鼠固定頸部、尾部用力往兩側(cè)拿，使動(dòng)物死亡肝臟↗脾臟腸↑腎臟胃↖橫膈膜←心臟←肺→頭部↗腦六、思考題1、石蠟切片的主要操作步驟有哪些？2、取材和固定組織時(shí)應(yīng)注意哪些問題？作業(yè)（實(shí)驗(yàn)報(bào)告）1.實(shí)驗(yàn)一顯微鏡的使用及細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察顯微鏡的原理、主要構(gòu)造與使用程序