酶分子的化學(xué)修飾

酶分子的化學(xué)修飾酶的修飾共價(jià)修飾非共價(jià)修飾化學(xué)修飾遺傳修飾第2頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶的化學(xué)修飾：在體外將酶分子通過(guò)人工方法與一些化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。從廣義上說(shuō)，凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去，都可稱為酶的化學(xué)修飾。第3頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

意義：1.基礎(chǔ)酶學(xué)的研究；活性部位的研究一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第4頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.提高生物活性；3.增強(qiáng)穩(wěn)定性；4.產(chǎn)生新的催化能力;5.解除免疫原性；第5頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)酶分子的修飾方法

一、酶的表面修飾酶分子表面的功能基：羧基、氨基、巰基、羥基、咪唑基等（一）小分子修飾：常用的小分子化合物主要：氨基葡萄糖、乙酸酐、硬脂酸、鄰苯二酸酐、乙酸-N-丁二酯亞胺酯等第6頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第7頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：α-胰凝乳蛋白酶表面的氨基修飾一NHCH2COOH后，穩(wěn)定性在60℃可提高1000倍。馬肝醇脫氫酶的賴氨酸的乙基化、糖基化和甲基化都能增加其活力，同時(shí)酶穩(wěn)定性也提高許多，底物專一性也有所改變。第8頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）大分子修飾

可溶性大分子：如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、右旋糖苷、環(huán)糊精、肝素等。第9頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第10頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：PEG修飾的L-天冬酰胺酶免疫原性顯著降低、半衰期延長(zhǎng)。天然過(guò)氧化氫酶在6h內(nèi)很快從血液中被去，PEG修飾后，酶活力在血液循環(huán)中可保持72h右旋糖苷修飾α-淀粉酶：60℃,t1/2：3.5min；修飾后：175minMPEG修飾過(guò)氧化氫酶，三氯乙烷中酶活是原來(lái)的200倍。第11頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）交聯(lián)修飾使用雙功能或多功能試劑將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)。（四）固定化修飾第12頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：枯草桿菌蛋白酶交聯(lián)酶晶體，其酶活提高13倍。葡聚糖二乙醛交聯(lián)青霉素G酰化酶，55℃下的半衰期提高9倍。絲氨酸氨白酶、胰蛋白酶通過(guò)交聯(lián)修飾，最適溫度從45℃提高到76℃。

第13頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天小分子修飾：穩(wěn)定性增加及一定催化特性的改變。大分子修飾：穩(wěn)定性增加；提高在非水相中的催化能力；免疫原性與抗原性降低、延長(zhǎng)半衰期。交聯(lián)修飾：提高其穩(wěn)定性，增加酶在非水溶液中的使用價(jià)值。

第14頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、酶分子的內(nèi)部修飾（一）催化活性基團(tuán)的修飾產(chǎn)生新的催化能力硫代烷基化反應(yīng)，枯草桿菌蛋白酶活性部位的Ser轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，對(duì)肽或酯無(wú)水解能力，但能水解硝基苯酯?；瘜W(xué)突變：將一種氨基酸側(cè)鏈化學(xué)轉(zhuǎn)化為另一種新的氨基酸側(cè)鏈的方法。第15頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天（二）非催化活性基團(tuán)的修飾改變酶的動(dòng)力學(xué)特征、影響酶的專一性。胰凝乳蛋白酶，Met192氧化成亞砜，該酶對(duì)含芳香族或大體積脂肪族的專一性底物的Km提高2-3倍。第16頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天（三）

蛋白質(zhì)主鏈的修飾依靠酶法，水解部分酶片斷。天冬氨酸酶有限水解切去10個(gè)氨基酸后，酶活提高5.5倍第17頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

（四）

與輔因子相關(guān)的修飾

1．依賴輔助因子的酶①

輔因子共價(jià)結(jié)合在酶上；

NADH共價(jià)結(jié)合到醇脫氫酶，活力為原來(lái)的40%,但解決了輔因子循環(huán)利用的問(wèn)題。

第18頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天②引入新的輔因子或?qū)o助因子進(jìn)行修飾。例：黃素共價(jià)結(jié)合在木瓜蛋白酶上，從而將蛋白酶轉(zhuǎn)變成氧化原酶。

修飾輔助因子，可創(chuàng)造出多種多樣的新酶。第19頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.金屬酶中的金屬取代酶分子中的金屬取代可以改變酶的專一性、穩(wěn)定性及其抑制作用。例：?；被崴饷富钚圆课恢械匿\被鈷取代后，酶的底物專一性和最適pH都有改變。第20頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

酶蛋白側(cè)鏈的小分子修飾

一、巰基的化學(xué)修飾烷基化試劑：有鹵代乙酸、芳香鹵、芳香族磺酸。常用的有碘代乙酸和碘乙酰胺、巰基乙醇。有機(jī)汞試劑：對(duì)氯汞苯甲酸(pCMB)專一性最強(qiáng)，修飾產(chǎn)物在250nm處有最大吸收。

第21頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天5，5’-二硫代-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）(Ellman試劑)，反應(yīng)生成的陰離子在412nm處有最大吸收。定量酶分子中巰基數(shù)目最常用的試劑。N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM)：反應(yīng)專一性很強(qiáng)的疏基修飾劑，反應(yīng)產(chǎn)物在300nm處有最大吸收。第22頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、氨基的化學(xué)修飾烷基化試劑：

碘代乙酸

三硝基苯磺酸（TNBS）：與賴氨酸殘基反應(yīng)，420nm，367nm能產(chǎn)生特定的光吸收。磷酸毗哆醛(PLP)是一種非常專一的賴氨酸修飾試劑，反應(yīng)可通過(guò)325nm處光吸收定量。第23頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2,4-二硝基氟苯（DNFB）法(又稱sanger試劑)；丹磺酞氯(DNS)法；苯異硫氰酸酯(PITC)法。用于多肽鏈N-末端殘基的測(cè)定的化學(xué)修飾方法。第24頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

三、羧基的化學(xué)修飾水溶性的碳二亞胺類特定修飾酶的羧基已成為最普通的標(biāo)準(zhǔn)方法，在一定條件下，絲氨酸、半胱氨酸和酪氨酸也可以反應(yīng)。第25頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、咪唑基的化學(xué)修飾焦碳酸二乙酯(DPC)和碘代乙酸。DPC對(duì)組氨酸殘基有較好的專一性，產(chǎn)物在240nm處有最大吸收，可跟蹤反應(yīng)和定量。DPC還可能修飾巰基，用連四硫酸鈉或連四硫酸鉀對(duì)巰基進(jìn)行可逆地保護(hù)。第26頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、吲哚基的化學(xué)修飾N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)：產(chǎn)物可通過(guò)280nm處光吸收的減少跟蹤反應(yīng)。2-羥基-5-硝基芐溴(HNBB)和4-硝基苯硫氯對(duì)吲哚基修飾比較專一。但易與巰基作用，修飾時(shí)應(yīng)對(duì)巰基進(jìn)行保護(hù)。第27頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

六、二硫鍵的化學(xué)修飾二硫蘇糖醇（DTT）巰基乙醇第28頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

七、酚基的化學(xué)修飾四硝基甲烷（TNM）：最常用的具高度專一性酪氨酸殘基的修飾劑。蘇氨酸和絲氨酸殘基：一般都可被修飾酚羥基的修飾試劑所修飾；二異丙基氟磷酸（DFP）對(duì)絲氨酸有高度反應(yīng)性。第29頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

八、胍基的化學(xué)修飾常用丁二酮、1，2-環(huán)己二酮、苯乙二醛。4-羥基-3-硝基苯乙二醛（405nm）對(duì)硝基苯乙二醛（340nm）具有光吸收性質(zhì)，并且產(chǎn)物具有旋光性，特別適合于精氨酸的定量。第30頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天化學(xué)修飾反應(yīng)的類型

1)烷基化反應(yīng)試劑特點(diǎn)：烷基上帶活潑鹵素，導(dǎo)致酶分子的親核基團(tuán)（如－NH2，-SH等）發(fā)生烷基化?？勺饔没鶊F(tuán)：氨基（Lys，Arg），巰基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。修飾劑：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。

第31頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天烷基化反應(yīng)第32頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2)?；磻?yīng)試劑特點(diǎn)：含有結(jié)構(gòu)，作用于側(cè)鏈基團(tuán)上的親核基團(tuán)，使之酰基化。可作用基團(tuán)：

氨基，巰基，醇羥基（Ser、Thr），酚羥基（Tyr）第33頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

?；磻?yīng)

第34頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3)氧化和還原反應(yīng)試劑特點(diǎn)：具有氧化性或還原性。氧化劑：H2O2可被氧化的側(cè)鏈基團(tuán):巰基，甲硫基，等。還原劑：2－巰基乙醇、DTT等?？杀贿€原的側(cè)鏈基團(tuán)：二硫鍵。第35頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)修飾劑Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亞胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－環(huán)己二酮、丁二酮Cys巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺二硫鍵巰基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羥基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺

各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑第36頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

酶蛋白側(cè)鏈的大分子修飾

常用修飾劑：聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、環(huán)糊精、蔗糖聚合物(Ficoll)、肝素、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚丙烯酸(PAA)、聚氨基酸、等?；罨盒揎梽┑幕罨?，即制備修飾劑衍生物。偶聯(lián)：與酶蛋白偶聯(lián)反應(yīng)。第37頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天proteinHalflifeinvivo(h)Injections/weekα-IFNβ-IFNHGHEPOG-CSFGM-CSF5.60.60.3652337377各類蛋白類藥物的體內(nèi)半衰期及注射次數(shù)第38頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天IFN-α2aand40kDa(PEG)–IFN-α2a的藥代動(dòng)力學(xué)

第39頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天酶

半衰期相對(duì)穩(wěn)定性

天然SOD6min1

右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240

聚乙二醇-SOD35h350蛋白類藥物修飾后的半衰期及穩(wěn)定性第40頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.PEG（PolyethyleneGlycol）簡(jiǎn)介：①

具有兩親性;②

無(wú)毒，免疫原性低;③

分子量范圍很寬，從幾百到數(shù)十萬(wàn)，選擇余地大;修飾劑一般為500～20000④

可以將它的許多優(yōu)良性質(zhì):如親水性，柔性、抗凝血性、抗巨噬細(xì)吞噬性等，賦予修飾后的生物分子。H(-O-CH-CH)n-OH第41頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天為避免在修飾過(guò)程中發(fā)生交聯(lián)和團(tuán)聚，通常采用單甲氧基聚聚乙二醇(mPEG)作為修飾劑。CH3(-O-CH-CH)n-OH第42頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第43頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.PEG的活化1)三氯均嗪法MPEG1

MPEG2

均三嗪，三聚氯氰第44頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天消化酶作用下的過(guò)氧化氫酶的活性保留第45頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2).N-羥基琥珀酰亞胺法第46頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第47頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一代PEG衍生物：反應(yīng)選擇性低；修飾后蛋白藥物的抗原性和半衰期改進(jìn)效果不明顯；容易引發(fā)蛋白質(zhì)的交聯(lián)與團(tuán)聚；衍生物與藥物反應(yīng)形成的連接鍵穩(wěn)定性不高。第48頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.N-末端氨基修飾PEG-醛蛋白質(zhì)N端α氨基的pKa為7.6~8.0，而分子內(nèi)賴氨酸的ε-氨基的pKa為10.0~10.2mPEG-醛與N端氨基的偶聯(lián)第二代PEG衍生物第49頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.疏基修飾①PEG-馬來(lái)酰亞胺②PEG-吡啶-二硫醚；③PEG-乙烯基砜④PEG-碘乙酰胺。第50頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.羧基端的修飾mPEG-酰肼或mPEG-胺mPEG-酰肼與羧基的偶聯(lián)第51頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天枝形PEG單鏈叉形PEG多鏈叉形PEG第52頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第53頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天第54頁(yè),共60頁(yè)，2024年2月25日，星期天產(chǎn)品號(hào)末端基團(tuán)分子量包裝（g）價(jià)格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001