選修生物技術實踐

選修生物技術實踐平陽中學生物組高翔實驗1

大腸桿菌的培養(yǎng)和分離第2頁,共49頁，2024年2月25日，星期天基本要求1．進行大腸桿菌的擴增，利用液體培養(yǎng)基進行細菌培養(yǎng)的操作。2．進行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進行細菌的劃線培養(yǎng)。發(fā)展要求說明大腸桿菌培養(yǎng)的條件和實驗原理。教學要求第3頁,共49頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌1、革蘭氏陰性2、異養(yǎng)兼性厭氧腸道桿菌4、基因工程中被廣泛應用①大腸桿菌質(zhì)?！d體②大腸桿菌——受體細胞3、繁殖方式：二分裂第4頁,共49頁，2024年2月25日，星期天培養(yǎng)：LB液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)分離：LB固體平面培養(yǎng)基劃線分離第5頁,共49頁，2024年2月25日，星期天一、實驗材料1、大腸桿菌菌種斜面：提供實驗用的大腸桿菌。2、LB液體培養(yǎng)基(溶菌肉湯培養(yǎng)基)（1）蛋白胨：（2）酵母提取液：（3）Nacl：（4）水：（瓊脂：凝固）生長因子：微生物生長不可缺少的微量有機物提供碳源、氮源、生長因子等。提供生長因子（維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等）維持滲透壓良好的溶劑，維持生物大分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。第6頁,共49頁，2024年2月25日，星期天二、實驗步驟1、液體培養(yǎng)基滅菌①滅菌對象：②滅菌方法：高壓蒸汽滅菌（1Kg/cm2壓力、121℃、15—30分鐘）（500g/cm2壓力、90℃以上、30分鐘）若有機物加熱會分解第7頁,共49頁，2024年2月25日，星期天灼燒滅菌干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。第8頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。而培養(yǎng)皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。

第9頁,共49頁，2024年2月25日，星期天2、分裝倒平板①操作環(huán)境：超凈工作臺。②操作前進行消毒：用酒精棉球擦拭桌面和手。③操作:使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害的微生物。消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法（低溫消毒法）:如牛奶的消毒c.化學藥劑消毒:酒精、氯氣、石碳酸、煤酚皂溶液等d.紫外線消毒方法第10頁,共49頁，2024年2月25日，星期天倒平板技術第11頁,共49頁，2024年2月25日，星期天1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？問題討論可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。第12頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染?？諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。5.如何判斷培養(yǎng)基是無菌的？將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第13頁,共49頁，2024年2月25日，星期天滅菌和消毒的比較滅菌消毒概念強烈的理化因素較為溫和的理化因素方法灼燒滅菌

干熱滅菌高壓蒸汽滅菌煮沸消毒法巴氏消毒法化學藥劑消毒紫外線消毒程度殺死芽孢和孢子不殺死芽孢和孢子第14頁,共49頁，2024年2月25日，星期天芽孢：有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。當環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細菌。第15頁,共49頁，2024年2月25日，星期天3、接種擴大培養(yǎng)接種環(huán)滅菌：灼燒滅菌第16頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4、劃線分離倒置

通過接種環(huán)在培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。第17頁,共49頁，2024年2月25日，星期天單菌落4、劃線分離

在數(shù)次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.第18頁,共49頁，2024年2月25日，星期天

平板劃線的操作方法交叉劃線法連續(xù)劃線法

第19頁,共49頁，2024年2月25日，星期天平板劃線時不能劃破培養(yǎng)基的原因一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。第20頁,共49頁，2024年2月25日，星期天問題討論1.為什么在操作的第一步灼燒接種環(huán)？1.操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？2.以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？3.劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第21頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4.第一次劃線后，每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)嗎？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。第22頁,共49頁，2024年2月25日，星期天4、劃線分離①接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次②劃線后培養(yǎng)皿倒置③培養(yǎng)基培養(yǎng)后：在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個菌落，表明菌已分離。第23頁,共49頁，2024年2月25日，星期天涂布分離法第一步：系列稀釋操作

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進行培養(yǎng)。第24頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第二步：涂布平板操作劃線分離：方法簡單涂布分離：單菌落更易分開，但操作復雜。第25頁,共49頁，2024年2月25日，星期天5、單菌落接種培養(yǎng)單菌落接種環(huán)劃線接種第26頁,共49頁，2024年2月25日，星期天菌種的保存1、臨時保藏：接種到固體斜面培養(yǎng)基，菌落長成后置于4℃冰箱保存。2、長期保存：甘油冷凍管藏法第27頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗討論

實驗完成后，接觸過細菌的器皿應如何處理？實驗完成后，所有接觸過細菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第28頁,共49頁，2024年2月25日，星期天擴展：可以用培養(yǎng)基對微生物進行分離(1)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分的改變可達到分離微生物的目的。如培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可以分離固氮微生物。又如加高濃度的食鹽,抑制多種細菌生長,分離到金黃色葡萄球菌。(2)當培養(yǎng)基的某種營養(yǎng)成分為特定化學成分時，也具有分離效果。如石油是唯一碳源時，可以抑制不能利用石油的微生物的生長，使能夠利用石油的微生物生存，達到分離出能消除石油污染的微生物的目的。(3)改變微生物的培養(yǎng)條件，也可以達到分離微生物的目的，如將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，只能得到耐高溫的微生物。第29頁,共49頁，2024年2月25日，星期天分析下面培養(yǎng)基的配方：葡萄糖、尿素、瓊脂、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O。請回答：(1)在該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長提供碳源和氮源的分別是________和________。(2)想一想這種培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，又是如何進行選擇的？葡萄糖尿素有選擇作用。因為此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(3)培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌、消毒方法依次是(

)①化學消毒②灼燒滅菌③干熱滅菌④紫外線滅菌⑤高壓蒸汽滅菌⑥巴氏消毒法A．⑤③②①④⑥B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤A第30頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗1：大腸桿菌的培養(yǎng)和分離設備及用品：滅菌鍋或高壓鍋、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直徑90mm的培養(yǎng)皿、接種環(huán)和玻璃三角刮刀、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、酒精燈和超凈臺、一次性塑料手套、裝有酒精棉球的廣口瓶、鑷子、有棉塞的試管（15mm×120mm）5支實驗材料：(1)50mlLB液體培養(yǎng)基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大腸桿菌菌種斜面(3)空白斜面

第31頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟(1)滅菌：將配制好的50mlLB液體培養(yǎng)基和50mlLB液體培養(yǎng)基分別裝入兩個250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高壓鍋進行滅菌。(2)制平板：在酒精燈火焰旁將固體培養(yǎng)基分別倒在4個培養(yǎng)皿中，使培養(yǎng)基鋪平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接種擴大培養(yǎng)：靠近酒精燈火焰將大腸桿菌接種到三角燒瓶的液體培養(yǎng)基中，三角燒瓶在37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。(4)劃線分離：將搖床上培養(yǎng)12h的菌液在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，然后將蓋好的培養(yǎng)皿倒置，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。(5)單菌落接種培養(yǎng)：在無菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在空白斜面上，在37℃下培養(yǎng)24h,4℃冰箱保存。第32頁,共49頁，2024年2月25日，星期天單菌落第33頁,共49頁，2024年2月25日，星期天實驗討論

實驗完成后，接觸過細菌的器皿應如何處理？實驗完成后，所有接觸過細菌的器皿都必須先高壓滅菌后再洗滌，特別是培養(yǎng)基，有可能被有害菌體污染，在培養(yǎng)繁殖后，大量有害菌體影響人畜健康，也污染環(huán)境，因此必須高壓滅菌。使用后的廢棄物也要高壓滅菌后再拋棄。對于取樣器的取樣頭，通常是滅菌后在超聲波清洗器中加洗衣粉洗滌綸30min,再用清水洗凈，仍可再用。封口膜也可再用。第34頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第36頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第37頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第38頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第39頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第40頁,共49頁，2024年2月25日，星期天第41頁,共49頁，2024年2月25日，星期