《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定 時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法》

ICS65.120

CCSB46

32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/Txxxx—2022

飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定

時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法

Determinationofdeoxynivalenolinfeeds

Timeresolvedfluorescenceimmunochromatographyquantitativemethod

2022--發(fā)布2022--實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/Txxxx—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。

本文件由江蘇省家禽科學(xué)研究所提出，由江蘇省畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本文件起草單位：江蘇省家禽科學(xué)研究所、上海雄圖生物科技有限公司。

本文件主要起草人：施壽榮、汪勁能、張鵬飛、肖蘊(yùn)祺、胡艷、邵丹、沈一茹、張珊、王強(qiáng)。

III

DB32/Txxxx—2022

飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定

時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法

1范圍

本文件規(guī)定了飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、樣

品前處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定、檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果計(jì)算和方法性能。

本文件適用于飼料原料、濃縮飼料、配合飼料、精料補(bǔ)充料等試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

時(shí)間分辨熒光微球timeresolvedfluorescentmicrosphere

形狀為球形，直徑在幾納米至幾十微米之間，微球表面或內(nèi)部負(fù)載有熒光物質(zhì)，在受到一定的能

量激發(fā)時(shí)能夠發(fā)出熒光的微粒，比普通熒光半衰期長(zhǎng)。微球表面修飾有合適密度的羧基或其它功能基

團(tuán)，用于與蛋白或抗體的共價(jià)偶聯(lián)；微球所包理的鑭系稀土元素經(jīng)過(guò)了鰲合，無(wú)需解離增強(qiáng)步驟。

3.2

時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法timeresolvedfluorescenceimmunochromatography

quantitativemethod

4原理

試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合后，抑制了層析過(guò)程中標(biāo)

記抗體與試紙條T線(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原的免疫反應(yīng)，使T線(xiàn)時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度降低，質(zhì)控線(xiàn)C

線(xiàn)結(jié)合的熒光標(biāo)記物濃度與樣品中玉米赤霉烯酮的濃度無(wú)關(guān)。層析結(jié)束后，通過(guò)儀器檢測(cè)計(jì)算試紙條

T線(xiàn)和C線(xiàn)的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度比值和設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

1

DB32/Txxxx—2022

5試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

5.1十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。

5.2磷酸二氫鉀（KH2PO4）。

5.3氯化鉀（KCl）。

5.4氯化鈉（NaCl）。

5.5鹽酸（HCl）。

5.6甲醇（CH3OH）。

5.7蔗糖（C12H22O11）。

5.8牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

5.9吐溫-20（C58H114O26）。

5.10磷酸鹽緩沖溶液：取2.178g磷酸氫二鈉（5.1）、0.144g磷酸二氫鉀（5.2）、0.12g氯化鉀

（5.3）、4.8g氯化鈉（5.4），溶解于1L水中，用適量鹽酸（5.5）調(diào)pH至6.8～7.2。

5.11提取液：取800mL甲醇（5.6）用純水定容至1L，用于樣品提取。

5.12稀釋液：在1L磷酸鹽緩沖溶液（5.10）中分別加入2.5g蔗糖（5.7）、1.0g牛血清白蛋白

（5.8）和2.0g吐溫-20（5.9）混勻，用于樣品上清的稀釋。

5.13脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度200mg/L。

5.14脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.13）1mL于2mL容量

瓶中，用甲醇（5.6）定容，混合均勻，制備成濃度為100mg/L的儲(chǔ)備液。

5.15ID卡：用于存儲(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和項(xiàng)目信息，直接插入熒光免疫定量分析儀使用。

5.16脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時(shí)間分辨熒光免疫層析定量試紙條（圖1）：靈敏度不低于100μg/kg。試

紙條結(jié)構(gòu)圖如下：

圖1脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時(shí)間分辨熒光免疫層析定量試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

注：結(jié)合墊包被熒光微球標(biāo)記的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體，T線(xiàn)包被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇封閉抗原，C線(xiàn)包被二

抗。

2

DB32/Txxxx—2022

5.17陰性樣本：玉米基質(zhì)空白樣本，嘔吐毒素含量＜25μg/kg。

6儀器和設(shè)備

6.1天平：感量0.01g，最大量程500g。

6.2渦旋振蕩器：0r/min～2500r/min。

6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

6.4微量可調(diào)移液器：20μL～200μL，0.1mL～1mL。

6.5干式恒溫孵育器：37.0℃±2.0℃（不帶鼓風(fēng)）。

6.6時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀：激發(fā)波長(zhǎng)：365nm±5nm、發(fā)射波長(zhǎng)：615nm±5nm，用于

讀取試紙條的熒光信號(hào)并自動(dòng)計(jì)算定量的檢測(cè)結(jié)果。

7樣品制備

按GB/T14699.1取樣，按照GB/T20195制樣備用。

8樣品前處理

8.1稱(chēng)取1.0g±0.02g樣品于10mL離心管中，用移液器（6.4）加入5mL提取液（5.11），用

渦旋振蕩器（6.2）振蕩提取5min，用離心機(jī)（6.3）4000r/min離心1min，上清備用；如果樣品

濃度過(guò)高，用提取液（5.11）稀釋。

8.2取100μL樣品提取液（8.1），加入到600μL稀釋液（5.12），混勻后待點(diǎn)樣檢測(cè)。

9標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定

9.1空白基質(zhì)溶液制備：取10g陰性樣品于100mL離心管中，加入50mL提取液（5.11），用渦旋

振蕩器（6.2）振蕩提取5min，用離心機(jī)（6.3）4000r/min離心1min，上清備用。

9.2分別吸取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.14）0.000mL、0.004mL、0.010mL、0.020mL、

0.060mL、0.120mL、0.200mL、0.300mL、0.400mL于5mL容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液（9.1）定

容，分別相當(dāng)于0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1000ng/mL、

1500ng/mL和2000ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

9.3取100μL標(biāo)準(zhǔn)工作液（9.2）分別加入600μL稀釋液（5.12），混勻后由低濃度到高濃度進(jìn)

行檢測(cè)（10）。儀器軟件可根據(jù)T線(xiàn)信號(hào)值與C線(xiàn)信號(hào)值的比值（T/C）和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對(duì)

數(shù)值（Inc）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

9.4同批次試紙條只需建立一次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與項(xiàng)目信息存儲(chǔ)于ID卡中，便于樣

品隨時(shí)隨地檢測(cè)。

10檢測(cè)過(guò)程

10.1將干式恒溫孵育器（6.5）開(kāi)機(jī)，設(shè)置溫度37℃，待溫度升至37℃后方可使用。

10.2時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀（6.6）預(yù)熱5min后，插入試紙條所對(duì)應(yīng)的ID卡（5.15）。

3

DB32/Txxxx—2022

10.3從鋁箔袋中取出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇熒光免疫定量檢測(cè)試紙條（5.16），水平放置于干式恒溫

孵育器（6.5）。

10.4用移液器（6.4）吸取100μL經(jīng)過(guò)前處理的待測(cè)樣品（8.2）加入試紙條的加樣孔中，蓋上孵

育器蓋開(kāi)始計(jì)時(shí)孵育6min。

10.5孵育結(jié)束后將試紙條（5.16）插入熒光免疫定量分析儀（6.6）的試紙條插槽中，點(diǎn)擊讀數(shù)。

11結(jié)果計(jì)算

樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)X計(jì)，數(shù)值以微克每千克（μg/kg）表示。儀器按如

下公式自動(dòng)計(jì)算。

P×V×n×1000

X=········································································(1)

m×1000

式中：

P—從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得的待測(cè)液中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V—樣品待測(cè)液體積的數(shù)值，單位為毫升（mL）；

n—樣品稀釋倍數(shù)；

m—樣品質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。

計(jì)算結(jié)果保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位。

12方法性能

方法的檢出限為25μg/kg，定量限為100μg/kg，檢測(cè)線(xiàn)性范圍為100μg/kg～10000μg/kg。

重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不超過(guò)算術(shù)平均值的20%。

A

A

4

目次

前言.............................................................................III

1范圍................................................................................1

2規(guī)范性引用文件......................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義..........................................................................1

4原理................................................................................1

5試劑和材料..........................................................................2

6儀器和設(shè)備..........................................................................3

7樣品制備............................................................................3

8樣品前處理..........................................................................3

9標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定........................................................................3

10檢測(cè)過(guò)程...........................................................................3

11結(jié)果計(jì)算...........................................................................4

12方法性能...........................................................................4

DB32/Txxxx—2022

飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定

時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法

1范圍

本文件規(guī)定了飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇測(cè)定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、樣品制備、樣

品前處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定、檢測(cè)過(guò)程、結(jié)果計(jì)算和方法性能。

本文件適用于飼料原料、濃縮飼料、配合飼料、精料補(bǔ)充料等試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適

用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T14699.1飼料采樣

GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

3.1

時(shí)間分辨熒光微球timeresolvedfluorescentmicrosphere

形狀為球形，直徑在幾納米至幾十微米之間，微球表面或內(nèi)部負(fù)載有熒光物質(zhì)，在受到一定的能

量激發(fā)時(shí)能夠發(fā)出熒光的微粒，比普通熒光半衰期長(zhǎng)。微球表面修飾有合適密度的羧基或其它功能基

團(tuán)，用于與蛋白或抗體的共價(jià)偶聯(lián)；微球所包理的鑭系稀土元素經(jīng)過(guò)了鰲合，無(wú)需解離增強(qiáng)步驟。

3.2

時(shí)間分辨熒光免疫層析定量法timeresolvedfluorescenceimmunochromatography

quantitativemethod

4原理

試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與時(shí)間分辨熒光微球標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合后，抑制了層析過(guò)程中標(biāo)

記抗體與試紙條T線(xiàn)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗原的免疫反應(yīng)，使T線(xiàn)時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度降低，質(zhì)控線(xiàn)C

線(xiàn)結(jié)合的熒光標(biāo)記物濃度與樣品中玉米赤霉烯酮的濃度無(wú)關(guān)。層析結(jié)束后，通過(guò)儀器檢測(cè)計(jì)算試紙條

T線(xiàn)和C線(xiàn)的時(shí)間分辨熒光強(qiáng)度比值和設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。

1

DB32/Txxxx—2022

5試劑和材料

除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。

5.1十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。

5.2磷酸二氫鉀（KH2PO4）。

5.3氯化鉀（KCl）。

5.4氯化鈉（NaCl）。

5.5鹽酸（HCl）。

5.6甲醇（CH3OH）。

5.7蔗糖（C12H22O11）。

5.8牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

5.9吐溫-20（C58H114O26）。

5.10磷酸鹽緩沖溶液：取2.178g磷酸氫二鈉（5.1）、0.144g磷酸二氫鉀（5.2）、0.12g氯化鉀

（5.3）、4.8g氯化鈉（5.4），溶解于1L水中，用適量鹽酸（5.5）調(diào)pH至6.8～7.2。

5.11提取液：取800mL甲醇（5.6）用純水定容至1L，用于樣品提取。

5.12稀釋液：在1L磷酸鹽緩沖溶液（5.10）中分別加入2.5g蔗糖（5.7）、1.0g牛血清白蛋白

（5.8）和2.0g吐溫-20（5.9）混勻，用于樣品上清的稀釋。

5.13脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：濃度200mg/L。

5.14脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（5.13）1mL于2mL容量

瓶中，用甲醇（5.6）定容，混合均勻，制備成濃度為100mg/L的儲(chǔ)備液。

5.15ID卡：用于存儲(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和項(xiàng)目信息，直接插入熒光免疫定量分析儀使用。

5.16脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時(shí)間分辨熒光免疫層析定量試紙條（圖1）：靈敏度不低于100μg/kg。試

紙條結(jié)構(gòu)圖如下：

圖1脫氧雪腐鐮刀菌烯醇時(shí)間分辨熒光免疫層析定量試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

注：結(jié)合墊包被熒光微球標(biāo)記的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇抗體，T線(xiàn)包被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇封閉抗原，C線(xiàn)包被二

抗。

2

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5.17陰性樣本：玉米基質(zhì)空白樣本，嘔吐毒素含量＜25μg/kg。

6儀器和設(shè)備

6.1天平：感量0.01g，最大量程500g。

6.2渦旋振蕩器：0r/min～2500r/min。

6.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥4000r/min。

6.4微量可調(diào)移液器：20μL～200μL，0.1mL～1mL。

6.5干式恒溫孵育器：37.0℃±2.0℃（不帶鼓風(fēng)）。

6.6時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀：激發(fā)波長(zhǎng)：365nm±5nm、發(fā)射波長(zhǎng)：615nm±5nm，用于

讀取試紙條的熒光信號(hào)并自動(dòng)計(jì)算定量的檢測(cè)結(jié)果。

7樣品制備

按GB/T14699.1取樣，按照GB/T20195制樣備用。

8樣品前處理

8.1稱(chēng)取1.0g±0.02g樣品于10mL離心管中，用移液器（6.4）加入5mL提取液（5.11），用

渦旋振蕩器（6.2）振蕩提取5min，用離心機(jī)（6.3）4000r/min離心1min，上清備用；如果樣品

濃度過(guò)高，用提取液（5.11）稀釋。

8.2取100μL樣品提取液（8.1），加入到600μL稀釋液（5.12），混勻后待點(diǎn)樣檢測(cè)。

9標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定

9.1空白基質(zhì)溶液制備：取10g陰性樣品于100mL離心管中，加入50mL提取液（5.11），用渦旋

振蕩器（6.2）振蕩提取5min，用離心機(jī)（6.3）4000r/min離心1min，上清備用。

9.2分別吸取脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（5.14）0.000mL、0.004mL、0.010mL、0.020mL、

0.060mL、0.120mL、0.200mL、0.300mL、0.400mL于5mL容量瓶中，用空白基質(zhì)溶液（9.1）定

容，分別相當(dāng)于0ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1000ng/mL、

1500ng/mL和2000ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

9.3取100μL標(biāo)準(zhǔn)工作液（9.2）分別加入600μL稀釋液（5.12），混勻后由低濃度到高濃度進(jìn)

行檢測(cè)（10）。儀器軟件可根據(jù)T線(xiàn)信號(hào)值與C線(xiàn)信號(hào)值的比值（T/C）和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對(duì)

數(shù)值（Inc）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

9.4同批次試紙條只需建立一次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，將建立好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與項(xiàng)目信息存儲(chǔ)于ID卡中，便于樣

品隨時(shí)隨地檢測(cè)。

10檢測(cè)過(guò)程

10.1將干式恒溫孵育器（6.5）開(kāi)機(jī)，設(shè)置溫度37℃，待溫度升至37℃后方可使用。

10.2時(shí)間分辨熒光免疫定量分析儀（6.6）預(yù)熱5min后，插入