醫(yī)學免疫學實習指導

屆學兔盛名

實習指導

主編:劉如意

主審:袁育康范桂香

參編：謝明王軍陽周曉勃雷艷君任會勛史霖

西安交通大學醫(yī)學院免疫教研室

二00四年一月

目錄

免疫學實驗的目的和要求.........................................................2

實驗室規(guī)則......................................................................2

第一篇非特異性免疫檢測........................................................3

實驗一血腦屏障作用........................................................3

實驗二吞噬細胞的功能試驗...................................................4

實驗三溶菌酶的溶菌作用....................................................7

實驗四血清總補體活性測定（CH50單位測定）................................9

第二篇特異性體液免疫檢測.....................................................11

實驗五凝集反應........................................................11

實驗六沉淀反應............................................................17

實驗七補體結合反應.......................................................25

實驗八中和實驗（Neutrlizationtest）......................................29

實驗九免疫標記技術.......................................................33

實驗十免疫血清的制備及效價測定...........................................40

實驗十一體外抗體形成細胞檢查法（溶血空斑實驗PFC）......................43

第三篇細胞免疫檢測............................................................46

實驗十二E-玫瑰花環(huán)形成實驗................................................46

實驗十三淋巴細胞轉化實驗..................................................48

第四篇：免疫病理反應...........................................................52

實驗十四豚鼠速發(fā)型過敏反應................................................52

實驗十五免疫復合物型超敏反應..............................................53

實驗十六豚鼠結核菌素試驗..................................................55

實驗十七小鼠DNFB試驗...................................................56

1

免疫學實驗的目的和要求

?每次實驗前必須做好預習，明確本次實驗的目的、內容、操作要點和相關的

理論知識。

-進入實驗室必須嚴格遵守實驗室規(guī)則。

?實驗中聽從老師指導，依照三嚴（嚴肅、嚴格、嚴密）要求進行實驗，做好

實驗記錄。

?認真觀察分析實驗結果，寫出實驗報告。實驗中遇到的有關問題，用科學的態(tài)

度總結探討其原因,培養(yǎng)分析問題和解決問題的能力。

實驗室規(guī)則

?進入實驗室必須穿好白大衣。

?除實驗中必須的學習用品外，不要放實驗臺上。

?實驗室內不允許吃食品、飲水，嚴禁吸煙。

?實驗中一定要保持實驗室安靜，不要大聲喧嘩，嚴禁打鬧。

?實驗要按老師要求操作，如發(fā)現(xiàn)問題要及時報告指導老師。

?愛護實驗器材，如有損壞應及時報告老師，需賠償者按規(guī)定辦理。

?實驗完畢要清理臺面，需沖洗者按要求沖洗，需收回者按要求擺放整齊收回。

?離開實驗室時，一定要有專人負責關好門窗、水源及照明設備。

2

第一篇非特異性免疫檢測

實驗一血腦屏障作用

［基本原理］

血腦屏障由軟腦膜、脈絡叢的毛細血管壁和包在壁外的神經(jīng)膠質細胞形成

的膠質膜構成，起著天然的屏障作用，可以阻擋病原微生物及毒性產物、異物

顆粒包括染料顆粒等從血流進入腦組織和腦脊液內，從而保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免

受損害。

［實驗材料］

2只小鼠。1ml無菌注射器（配4號針頭）。5%臺盼藍水溶液。

生理鹽水0.Imlo眼科剪子和鏡子等。

［實驗方法］

?用1ml無菌注射器吸取5%臺盼藍水溶液經(jīng)尾靜脈注入兩只小鼠體內，每只

0.7mL更換注射器，給其中一只小鼠顱內注射生理鹽水0.1ml。

?5-10分鐘后觀察小鼠皮膚，尤其是眼、嘴的顏色變化。

-于30-60分鐘，見小鼠眼、嘴呈現(xiàn)藍色，即窒息死亡，腹部向下固定。

?由頭到尾沿背中線剪開皮膚，暴露皮下、肌肉和內臟，觀察顏色變化。

?小心剖開顱骨和椎骨，暴露腦和脊髓，與皮下、肌肉及內臟比較；并比較2

只小鼠有何不同。

［實驗結果］

未經(jīng)顱內注射的小鼠，眼、耳、鼻皮下及肌肉均呈現(xiàn)明顯的藍色，但腦、脊髓

均未變色；而經(jīng)顱內注射的小鼠上述部位可呈現(xiàn)明顯的藍色。

［注意事項］

?臺盼藍水溶液要經(jīng)過濾后方可使用。

?尾靜脈注射要從遠斷進針；如推注容易，表明進入了血管；如引起皮下凸起

或發(fā)白，說明未進入了血管；拔出針頭，從稍近斷進針。

（謝明）

3

實驗二吞噬細胞的功能試驗

巨噬細胞能吞噬雞紅細胞、中性粒細胞可吞噬多種細菌，如葡萄球菌等。將巨

噬細胞和中性粒細胞分別與雞紅細胞、表皮葡萄球菌混合，孵育一定時間后涂

片染色鏡檢；見巨噬細胞可吞噬雞紅細胞；中性粒細胞可吞噬葡萄球菌，可計

算出吞噬異物的細胞數(shù)和吞噬細胞中吞入的異物數(shù)。在巨噬細胞中亦可見到雞

紅細胞發(fā)生形態(tài)改變。具此可判斷兩類吞噬細胞的吞噬功能和消化功能，用以

評價機體的免疫狀態(tài)。

［實驗目的］

證實吞噬細胞的吞噬作用。了解機體的非特異免疫防護作用。

一、豚鼠腹腔巨噬細胞吞噬作用測定（大吞噬）：

［基本原理］

淀粉可以刺激豚鼠腹腔引起非感染性炎癥滲出，在腹腔局部出現(xiàn)較多巨噬細胞,

巨噬細胞則能吞噬注入腹腔的雞紅細胞等較大異物。

［實驗材料］

?實驗動物：豚鼠

?雞紅細胞懸液：從雞翼下靜脈或心臟取血，按1:5比例保存于Alsever氏

保養(yǎng)液中，放4C°冰箱可用1個月，用前將雞紅細胞用生理鹽水洗3次，第3次

洗滌2000r/min,5min,棄上清，壓積細胞用生理鹽水配制為5%雞紅細胞懸液，

供大吞噬試驗用。

?5%淀粉肉湯溶液、姬姆薩染液、玻片、注射器等。

［實驗方法］

?取無菌5%淀粉肉湯溶液51nl注入豚鼠腹腔，常規(guī)飼養(yǎng)三天；實驗前1小時再次

注入豚鼠腹腔無菌5%淀粉肉湯溶液5mL然后注射5%雞紅細胞懸液5ml,輕揉其

腹部，使雞血球均勻分布。

?在注射后30分鐘、1小時、2小時、3小時、分別用注射器抽取豚鼠腹腔液推

片。

?自然干燥后，姬姆薩染色，油鏡觀察。

［實驗結果］

4

計算100個巨噬細胞中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)目及被吞噬的雞紅細胞的總

數(shù)，并觀察雞紅細胞的消化程度，按下列公式計算吞噬百分比和吞噬指數(shù)。

吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)i

吞噬百分比---------；--------------XJLUU為

10吐巨噬細胞

100個巨噬細胞中被吞噬雞紅細胞數(shù)

吞噬指數(shù)=X100%

100個巨噬細胞

雞紅細胞被消化的程度分4級：

I級：未消化，胞質淺紅或淺黃，胞核淺紫紅色。

n級：輕度消化，胞質淺黃綠色，核固縮，成紫藍色。

m級：重度消化，胞質淡染，胞核呈淺灰黃色。

w級：完全消化，巨噬細胞內只見形狀類似雞紅細胞大小

的空泡，邊緣正齊，胞核隱約可見。

二中性粒細胞吞噬作用的測定（小吞噬）：

［基本原理］

血液中的中性粒細胞有吞噬病原微生物等較小異物的能力。將新鮮血液和細菌

混合，經(jīng)合適的時間后涂片染色，即能觀察到被吞噬到中性粒細胞內的但還沒

有被消化掉的細菌。

［實驗材料］

?白色葡萄球菌：肉湯培養(yǎng)液中37C0培養(yǎng)16-18小時待用。

,新鮮抗凝人血0.5mlo

?瑞氏染液、顯微鏡、孵箱、玻片等。

［實驗方法］

1.吸取0.1ml白色葡萄球菌液加入新鮮抗凝人血0.5ml中，搖勻，37C°孵育

30分鐘。

2.孵育過程的前20分鐘，每隔5分鐘輕輕振蕩一次，共4次，后10分鐘靜置孵

育。

5

?孵育結束后，用毛細滴管從紅細胞層表面吸取上清少許推片。

?自然干燥后，滴加瑞氏染液染色1分鐘，再加等量蒸儲水混勻，靜置4分鐘水

洗，晾干油鏡觀察。

［實驗結果］

計算100個中性粒細胞，分別計算吞噬有細菌的中性粒細胞數(shù)目和被吞噬的細

菌總數(shù)，計算吞噬百分比和吞噬指數(shù)，正常人吞噬百分比為60%,吞噬指數(shù)大于

1=（計算方法同前）

［注意事項］

?血涂片應薄厚均勻適中，避免過薄或過厚。

?瑞氏染液染色時間不能過長以免染色過重。

（謝明）

6

實驗三溶菌酶的溶菌作用

［實驗目的］

證實體液中溶菌酶的存在及溶菌酶對革蘭氏陽性菌的溶解作用。

［基本原理］

溶菌酶的殺菌機理是其作用于細菌細胞壁的粘肽層，粘肽是細菌的細胞壁主要

成分。溶菌酶能切斷粘肽結構中的N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的B-

1,4糖昔鍵，破壞粘肽支架，使細胞壁破壞。由于細菌細胞壁的重要功能之一是

保護細菌，即抗低滲，故細菌失去細胞壁的保護作用后，在低滲環(huán)境中可發(fā)生

溶解。溶菌酶的主要作用對象是革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性細菌細胞壁粘肽層

外還有脂多糖、外膜和脂蛋白結構，故在一般情況下溶菌酶不易發(fā)揮直接做用。

［實驗材料］

?溶壁微球菌(M.Lysodeikticus)：本菌是由空氣中分離出的一種革蘭氏陽性

菌，對人不致病，菌落黃色，普通瓊脂培養(yǎng)基生長良好，每月傳代一次或凍干

保存，用于制備溶壁微球菌瓊脂平板。

?標準溶菌酶：稱取溶菌酶標準純品，用l/15mol.L-1PBS配制為1000ug/ml

原液，并稀釋為100、50、10ug/ml標準液，用前保存在冰箱中；用于陽性對照

及制備標準曲線。

?唾液：用無菌平皿收集唾液，可在同學間收集。

?其它：無菌打孔器(孔徑2mm),無菌毛細吸管、米尺等。

［實驗方法］

?用無菌打孔器在溶壁微球菌瓊脂平板上打孔，用針頭挑出孔內瓊脂，孔徑2mm

左右，孔距5-20mm。

?用毛細吸管取新鮮收集的睡液加入瓊脂孔內，每孔加一滴，每滴約有0.025ml,

同時加標準溶菌酶作陽性對照。

?置24-28C°下12-18h觀察結果。

［實驗結果］

用小米尺或三角板量取小孔周圍溶菌環(huán)直徑，并作記錄，可與標準溶菌酶陽性

對照作對比觀察。

7

如需定量測定檢品（唾液）中的溶菌酶含量，可將上述各種稀釋度的溶菌酶標

準溶液，分別加入小孔中，同法測定溶菌環(huán)直徑，用半對數(shù)紙制成標準曲線，

檢品中的溶菌酶含量可從標準曲線上查出。

［附錄］

?溶壁微球菌瓊脂平板的制作：①溶壁微球菌在使用前于瓊脂斜面上傳代一次,

然后接種于普通瓊脂平板，37C°培養(yǎng)24小時，用l/15mol.LTPBS或無菌蒸儲

水洗下菌苔，洗滌兩次，2000r/min,離心30min,棄上清，稱量沉淀物濕重，用

無菌蒸儲水配成100mg/ml的菌液。②稱取優(yōu)質瓊脂粉1g加入l/15mol.L-1PBS

100ml,制成1%瓊脂。③取上述菌液1ml,加入加熱融化并放至50-60C°的瓊脂

中，搖勻傾注平板。冷凝后即為溶壁微球菌瓊脂平板。

?l/15mol.L-1PBS的制備：0l/15mol.L-1KH2P04:KH2P049.07g加蒸儲

水至1000ml；@l/15mol.L-1Na2HP04:l/15mol.L-1Na2HP041L87g力口蒸播

水至1000ml；③至15mol.L-1PBS（pH6.4）：取l/15mol.L-1KH2P0473ml加

l/15mol.L-1Na2HP0427mL加NaCLO.5g即為pH6.4的l/15mol.L-1PBS.

（謝明）

8

實驗四血清總補體活性測定(CH50單位測定)

［實驗原理］

補體能使抗體致民敏的羊紅細胞發(fā)生溶血反應,根據(jù)溶血程度可測定補體總活

性。以溶血百分率作縱坐標,相應的血清補體量為橫坐標繪圖,可知在50%溶血附

近補體的量與溶血的程度呈直線關系。因此以50%溶血作為終點較以100%溶血作

為終點更為敏感。故稱為50%溶血試驗，即CH50(50%complementhemolysis)。

產生50%溶血所需補體的量為一個CH50單位。

［實驗材料］

待測患者血清

5%綿羊紅細胞懸液

3u/0.1ml溶血素

PH7.2巴比妥緩沖液或生理鹽水

370c水浴箱、小試管、吸管等

［實驗方法］

取小試管8支，依次編號；

1-6管加入巴比妥緩沖液0.2ml；

于第1管加入待測血清0.2ml,混勻后吸出0.2ml加入第2管……依次對倍稀釋

至第6管，從第6管吸取0.2ml棄去，此時各管血清稀釋度依次為1/2、1/4、

1/8...1/64；

1-6管加入巴比妥緩沖液0.2ml,第7管加0.4ml,第8管加0.5ml,

1-7加溶血素0.1ml；

每管各加綿羊紅細胞0.1ml,輕輕搖勻，置370C水浴箱30分鐘,40C冰箱過夜。

血清總補體活性測定操作表單位：ml

9

試管號12345678

巴比妥緩沖液0.20.21、0.2；\

待測血清0.2」0.2」0,2」0.2」0.2」0.2」—棄去Q2

巴比妥緩沖液0.20.20.20.20.20.20.40.5

溶血素0.10.10.10.10.10.10.1-

5%綿羊紅細胞0.10.10.10.10.10.10.10.1

6為實驗測定管；第7管為溶血素對照管；第8管為綿羊紅細胞對照管

50%標準溶血管的配置：

取5%綿羊紅細胞1ml,離心后棄上清,加入蒸儲水0.5ml,使紅細胞全部溶解,再加

雙倍（1.7%）生理鹽水0.5ml,混勻后加5%綿羊紅細胞1ml?；靹蛉〈艘?.1ml加

巴比妥緩沖液0.5ml即為50%標準溶血管。

［實驗結果］

以50%溶血管為標準，肉眼依次觀察，與標準管最接近者為終點管。按下式計算

1ml血清的補體單位。

血清中補體活性單位（CH50單位）=1/血清總量X終點管稀釋倍數(shù)

本法測得血清總補體活性的正常值為80-160CH50u/ml

［注意事項］

待測血清要求新鮮，一般要求在去血后2小時做完實驗。

試管口徑大小一致，清潔透明，便于觀察。

50%標準溶血管配置必須用同批實驗用綿羊紅細胞，并同時方入冰箱。

思考題：

何謂一個CH50單位？何謂溶血素？

如何計算每ml血清所含的CH50單位數(shù)？

（劉如意）

10

第二篇特異性體液免疫檢測

實驗五凝集反應

凝集反應是指細菌、紅細胞等顆粒性抗原或表面覆蓋抗原的顆粒狀物質與相應

抗體特異結合，在適量電解質存在的條件下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

一、直接凝集反應

顆粒性抗原(如細菌、紅細胞等)直接與相應特異性抗體結合，在適量電解質

存在條件下，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱直接凝集反應。參加凝集反應的抗

原稱為凝集原，而抗體則稱為凝集素。直接凝集反應有玻片法和試管法兩類。

(-)玻片凝集反應

在玻片上進行的直接凝集反應,主要用于抗原的定性分析,數(shù)分鐘之內便可觀察

結果,快速、簡便。常用于細菌的分型鑒定,也用于ABO血型的測定。

【實驗材料】

(1)抗原：受檢菌液或受檢者的血細胞鹽水懸液。

(2)抗體：用于細菌鑒定的1：20稀釋診斷血清。

血型檢測的A及B診斷血清。

(3)生理鹽水、玻片、吸管、接種環(huán)。

(實驗方法】

(1)于潔凈玻片的一端加診斷血清1滴，另一端加生理鹽水1滴作陰性對照。

(2)用接種環(huán)取待檢菌液或血細胞懸液分別涂于診斷血清和生理鹽水，混勻。

(3)輕搖玻片，靜置數(shù)分鐘，觀察結果。

【結果分析】

玻片上抗原凝集成肉眼可見的小團塊狀或絮狀凝集物，其周圍液體澄清，為陽

性反應。陰性反應和生理鹽水對照均不發(fā)生凝集，為均勻混濁的乳狀液。

［注意事項】

11

細菌鑒定時，特別是腸道菌種的沙門菌屬或志賀菌屬，原則上先用多價診斷血

清檢測，如為陽性，再用單價診斷血清進行分群或定型。血型測定時，室溫需

保持在200c左右，若低于10oC,易出現(xiàn)冷凝集現(xiàn)象而造成假陽性的錯誤診斷。

(-)試管凝集反應

是用定量的顆粒性抗原懸液與一系列倍比稀釋的待檢血清在試管中進行的凝集

反應，根據(jù)試驗結果判定待檢血清中有無相應抗體及其效價，對血清中抗體進

行半定量分析。此法目前仍常用于某些病原微生物感染的免疫學診斷，例如，

診斷傷寒和副傷寒的肥達氏(Widaltest)反應，診斷斑疹傷寒的外一裴氏反

應(weil-felixtest)。

［實驗材料】

診斷菌液，1:10稀釋的待檢血清，生理鹽水，小試管，刻度吸管，試管架，恒

溫水浴箱。

［實驗方法】

(1)稀釋待檢血清取8支試管排列于試管架上,依次編號,每管加入0.5ml生理鹽

水。于第1管中加入0.5ml待檢血清，充分混勻后，吸出0.5ml加入第2管，同法混

勻后又吸出0.5ml加入第3管,依次類推,連續(xù)稀釋至第7管,最后從第7管中吸出

0.5ml棄去。第8管為生理鹽水對照管。

(2)于各管中加入診斷菌液0.5ml,振搖試管架，充分混勻。

試管凝集反應操作程序

試劑12345678

生理鹽水0.510.510.5[0.5-10.5-10.50.510.5

待檢血清0.5J<0.5卜，0.5八0.540.540.5廠0.5戶、棄去0.5

血清稀釋倍數(shù)1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

診斷菌液0.50.50.50.50.50.50.50.5

(3)將試管靜置于370c恒溫水浴箱中40min。

【結果分析】

(1)首先觀察陰性對照管，應無凝集現(xiàn)象，管底沉積呈圓形，邊緣整齊，輕

輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現(xiàn)象。

?觀察實驗管，凝集現(xiàn)象可根據(jù)強弱程度，分為五級：

12

++++細菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++細菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。

++約半數(shù)的細菌發(fā)生凝集，管底出現(xiàn)凝集環(huán)。

+僅有少部分細菌凝集，管底可見沉積的細菌周邊有稀疏、點狀的凝集物。

一液體混濁，無凝集。

（3）血清抗體效價的判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象（++）的血清最高稀釋度作

為受檢血清的抗體效價。

【注意事項】

實驗中應注意反應體系的溫度、電解質濃度及酸堿度（pH值）。

二、間接凝集反應

將可溶性抗原（或抗體）先吸附在一種與免疫無關，一定大小的載體顆粒表面

成為致敏載體顆粒，然后與相應抗體（或抗原）結合，在適量電解質存在的條

件下，出現(xiàn)肉眼可見的特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應，此法敏感度比直接

凝集反應高，因而廣泛地應用于臨床檢測中，間接凝集反應中常用的載體顆粒

有人“0”型紅細胞、動物紅細胞、活性炭或硅酸鋁顆粒，聚苯乙烯乳膠微球

（-）正向間接血凝試驗

將綿羊紅細胞或人的“0”型紅細胞用醛類固定（稱為醛化，可改變血球表面

性質，使其易于吸附蛋白質類抗原，并可長期保存使用），再將可溶性抗原吸附

于醛化的血細胞上，制成抗原致敏的紅細胞，當與相應的抗體結合，使紅細胞

被動的聚合在一起，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象，常用于檢測傳染病抗體或自身

抗體。

【實驗材料】

（1）抗原制備：將傷寒桿菌接種在培養(yǎng)基上，37oC培養(yǎng)24小時，用生理鹽水

洗下，100oC水浴2小時，離心棄上清，稀釋后備用。

（2）致敏紅細胞的制備：取稀釋的抗原與等體積的己醛化的2%SRBC混合，37oC

水浴2小時，每隔15分鐘振搖一次，取出后洗滌棄上清，稀釋成0.5%備用。

（3）試管、試管架、刻度吸管、恒溫水浴箱。

（實驗方法】

13

(1)取8支小試管排列于試管架上，依次編號。每管加入0.25ml生理鹽水。于

第1管內加入1:10稀釋的免疫血清0.25ml混勻，倍比稀釋至第7管。第8管為陰性

對照。

(2)每管中加入0.25ml致敏綿羊紅細胞，振搖試管架，使之充分混勻。

(3)將試管架靜置于370c恒溫水浴箱中1小時。

正向間接血凝試驗操作程序

試劑12345678

生理鹽水0.2510.25[0.25]0.2及0.25[0.25^0.25]0.25

八0.25「、0.25八0.25廠0.25八0.25J、棄去0.5

1:10免疫血清0.25」“0.25

血清稀釋倍數(shù)1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

致敏SRBC0.250.250.250.250.250.250.250.25

［結果分析］

(1)首先觀察陰性對照管，應無凝集現(xiàn)象，管底紅細胞沉積呈圓形，邊緣整

齊，輕輕搖動則沉積菌分散均勻呈混濁現(xiàn)象。

(2)觀察實驗管，凝集現(xiàn)象可根據(jù)強弱程度，分為五級：

++++細菌全部凝集，管底形成大片凝集物。

+++細菌大部分凝集，管底的片狀凝集物較小而薄。

++約半數(shù)的細菌發(fā)生凝集，管底出現(xiàn)凝集環(huán)。

+僅有少部分細菌凝集，管底可見沉積的細菌周邊有稀疏、點狀的凝集物。

—液體混濁，無凝集。

(3)血清抗體效價的判定：以出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象(++)的血清最高稀釋度作

為受檢血清的抗體效價。

［注意事項】

?紅細胞需來自同一個體、批號相同，且致敏血球應新鮮配置。

?使用器材必須清潔，否則對結果有很大影響。

14

(二)反向間接血凝試驗

將特異性抗體吸附于醛化的紅細胞上，再與相應抗原結合，在適量電解質存在

條件下，紅細胞被動聚集出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象。用于檢測標本中的相應可溶

性抗原。

【實驗材料】

(1)1：20抗一血$致敏的醛化血球、純化的1:20抗一HBs、待檢血清、稀釋液。

(2)“V”型微量血凝板，0.025ml稀釋棒、微量攪拌器、刻度吸管、滴管(40

滴/ml)。

【實驗方法】

(1)配制致敏血球懸液于每瓶凍干診斷血球加41nl稀釋液，輕輕旋搖使成均

勻血球懸液，濃度約為0.6%。

(2)正式試驗

①在“V”型微量血凝板上，每份待檢血清設立8孔，于各孔內用40滴/ml滴管

各加1滴稀釋液(相當于0.025ml)。

②用0.025ml容量的稀釋棒蘸滿待檢查血清分別依次在各孔內捻轉作倍比稀釋

(一般每孔內均需捻轉10次左右)，直至第7孔，第8孔為致敏血球對照。另設第

9孔為陽性對照，加0.025mlHBsAg陽性血清。

③于每孔中加0.025ml混勻的致敏血球懸液。

④將血凝板置于微型振蕩器上振蕩「2分鐘，置370cl小時后觀察結果。

反向間接血凝試驗操作程序

試劑123456789

生理鹽水0.2510.2510.25-10.2510.25i0.2510.2510.25陽性血清

恃檢血清0.25卜0.25J\.25-1?O.25,1，0.25）、0.25八0.25；、^去0.25

血清稀釋倍數(shù)1:201:401:801:1601:3201:6401:1280—

致敬SRBC0.250.250.250.250.250.250.250.25

【結果分析】

不凝集：紅細胞全部下沉，集中于孔底，形成致密的圓點。

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明顯凝集（++）:紅細胞于孔底形成薄膜狀凝集，中央可見疏松的紅點。

出現(xiàn)明顯凝集的血清最高稀釋度為HBsAg效價，凡效價21:16者需進一步做中

和試驗。

中和試驗

在血凝板上每份標本設測定排與對照排，每排8孔。于每孔加稀釋液0.025ml,

用2支稀釋棒蘸取被檢血清，分別在2排作倍比稀釋到第7孔，第8孔不含血清，

為血球對照，然后，于測定排各孔加稀釋液0.025ml,對照排各孔加1:20抗

HBsAgO.025ml,血凝板振蕩1~2分鐘，置370c30分鐘。取出，于各孔加0.025ml

致敏血球，振搖混勻，置370cl小時后觀察結果。

凡正式試驗效價21:16,且中和試驗的對照排凝集孔數(shù)至少低于測定排凝集孔

數(shù)2孔者，為HBsAg陽性，否則系非特異性凝集。

【注意事項】

（1）配制的致敏血球懸液一般當天用完，若置2~10oC,使用期不超過3天。

（2）試驗用的血凝板、滴管、稀釋棒等器材必須十分清潔，否則易造成非特

異性凝集。

?血凝板、稀釋棒用后均需用次氯酸鈉（10%v/v）浸泡過夜；滴管需煮沸10分

鐘，然后用水沖凈，再用蒸儲水沖洗，晾干備用。

思考題：

?試述直接凝集反應和間接凝集反應的異同點。

?正向間接血凝試驗與反向間接血凝試驗在原理上有何相同和不同？正向間接

血凝試驗可否應用微量血凝板測定法？

（雷艷君）

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實驗六沉淀反應

可溶性抗原（如血清中的蛋白，組織浸出液，細胞裂解液等）與其相應的抗體在

溶液中或凝膠中結合,若比例合適,可形成肉眼可見的抗原-抗體復合物,這就是

免疫沉淀反應。免疫沉淀反應可以在小玻璃管中或毛細玻璃管及凝膠平板中進

行。在用凝膠平板做實驗時,常用瓊脂糖凝膠做介質,有的加電流,使反應更快更

靈敏。

一、環(huán)狀沉淀

【實驗原理】

在環(huán)狀沉淀試管中，當可溶性抗原與相應特異性抗體結合后，于兩者交界面處

可形成白色沉淀環(huán)。此法系Ascoli于1902年建立，用于檢查獸類內臟、皮毛浸

液等標本中炭疽桿菌抗原，由于其較高的靈敏性和特異性，目前仍用于法醫(yī)學

血跡鑒定、流行病學媒介昆蟲的吸血習性鑒定等。

［實驗材料】

待測血跡干燥紙片

抗人血清抗體、抗羊血清抗體和抗雞血清抗體

生理鹽水

環(huán)狀沉淀管及管架、吸管等。

【實驗方法】

1、取環(huán)狀沉淀管3支，分別加入抗人、抗羊和抗雞血清抗體各0.1ml于管底部,

并注明，置于管架上。

2、另取3支試管，分別將3種血跡紙片加入，再各加生理鹽水1ml,室溫5-10分

鐘后將溶液搖勻。

3、吸取上清液分別加入上述含有抗人、抗羊、抗雞血清抗體的環(huán)狀沉淀管內，

并使兩者形成一清晰交界面。置室溫下『5分鐘觀察結果。

［結果分析］

根據(jù)是否與已知抗血清出現(xiàn)白色沉淀環(huán)，判定血跡類型。

【注意事項】

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1、因血清分子密度及比重均大于生理鹽水，故當加入含有抗原的生理鹽水時只

需將沉淀管傾斜，加抗原的吸管勿接觸抗血清，使含抗原的生理鹽水沿管壁緩

緩流下，再將沉淀管直立即可呈一清晰交界面。

2、在加抗原時，吸管的頭部切勿觸及抗血清，否則不僅使抗原抗體混合，不能

呈清晰交界面，而且如再用此吸管加抗原于另一支含不同抗血清的沉淀管后，

必然會出現(xiàn)交叉反應，無法判定結果。

二單向擴散

【實驗原理】

抗原或抗體這兩種成分中只有一種擴散，將已知抗體與瓊脂混合，將抗原

置于凝膠孔中，抗原則呈輻射狀擴散，在孔的周圍與抗體結合，在比例合適的

地方形成肉眼可見的沉淀環(huán)。當抗體的濃度一定時，抗原的濃度與形成沉淀環(huán)

的直徑成正比。

［實驗材料】

1%瓊脂糖（瓊脂糖lg,O.Imol/LpH8.6巴比妥-巴比妥鈉緩沖液100ml）,玻片

或培養(yǎng)皿，凝膠打孔器（直徑3mln）,水浴箱，10ml吸管，5口1微量加樣器，

已知抗體，標準抗原，待測抗原。

【實驗方法】

1）取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水

平臺備用。

2）將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫

3）取15ml瓊脂糖加到56°C預熱的玻璃管中，加入適量的抗體（約200ml）

充分混勻后平鋪于玻璃片上。

4）待凝膠凝固后打孔（直徑3mm）

5）將系列稀釋的標準抗原和待檢抗原分別加到凝膠孔中，每孔5111

6）將凝膠板置于濕盒，室溫過夜（24h以上）后觀察結果八

7）繪制標準曲線，測出樣品中相應抗原含量。

［結果分析］

1本實驗主要用于檢查血型中IgG,IgA，IgM以及補體成分C3,C4等

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的含量/由于各類免疫球蛋白的分子量大小不等，因此同樣濃度的IgG,

IgA,IgM在瓊脂糖中的擴散速度各異，IgG擴散最快，形成的沉淀環(huán)直徑

最大，IgM的分子量最大，擴散速度慢，形成的沉淀環(huán)較小。

2形成的沉淀環(huán)大小與抗原或抗體的濃度相關，因此臨床檢測時應先調整抗體

和抗原各自的最適濃度，抗體的最適濃度應使免疫擴散后的沉淀環(huán)邊緣清晰，

且能測出血清中的免疫球蛋白的正常值和最大限度的異常值?？贵w濃度過高，

形成的沉淀環(huán)直徑?。粷舛冗^低，不易檢測抗原的最高限濃度。沉淀環(huán)的大小

與所檢測的抗原濃度成正比?？乖瓭舛冗^低時，沉淀環(huán)太小不易測定，過高時,

沉淀環(huán)太大，浪費抗體。

沉淀環(huán)

單向擴散示意圖

三雙向擴散

【實驗原理】

雙向免疫擴散是指抗原和抗體在同一凝膠內部擴散，彼此相遇后形成特

異性的沉淀線。該反應是將抗原和抗體加入同一凝膠中兩個相隔一定間距的小

孔內，使兩者進行相互擴散。當抗原和抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成

一白色弧型沉淀線。

【實驗材料】

1%瓊脂糖，玻片或培養(yǎng)皿，凝膠打孔器（直徑3mm）,水浴箱，10ml

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吸管，5u1微量加樣器，抗原，抗體。

【實驗方法】

1）取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水平

臺備用。

2）將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫。

3）將1%凝膠約3ml鋪于玻片上，待凝固后打孔，直徑3mm,間距10mm。

（如圖所示）

4）中心孔加5u1抗體，周圍孔內每孔加5u1抗原樣品（抗原抗體均

需預先做系列稀釋以獲得適宜的抗原抗體比例）。

5）將凝膠板置于濕盒，室溫過夜（24h以上）后觀察結果。

［結果分析］

1）陽性結果為在抗原孔與抗體孔之間出現(xiàn)沉淀線。若出現(xiàn)幾條沉淀線表明抗

原與抗體均不是單一組分。

2）此法可用來比較兩個抗原的相關性。當兩種抗原的決定簇完全相同時，則

與抗體形成的沉淀線相吻合；若兩抗原的決定簇完全不同時，則與抗體形成的

沉淀線呈不相關的交叉線；若兩種抗原有部分決定簇相同時，則與抗體形成呈

部分交叉的沉淀線。

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四火箭電泳

將抗原抗體反應置于一定的電場中進行，能使抗原抗體反應更加快速，靈敏。

根據(jù)方法的不同，主要有火箭電泳，對流免疫電泳，交叉免疫電泳等。

［實驗原理】

火箭電泳是把單向擴散技術與電泳技術結合起來?？乖诤锌贵w的瓊

脂糖凝膠中電泳時，在電場的作用下，抗原向一個方向移動并逐步與凝膠中的

相應抗體結合形成沉淀峰。沉淀峰的高度與抗原的濃度成正比。

［實驗材料】

1%瓊脂糖，玻片或培養(yǎng)皿，凝膠打孔器（直徑3mm）,水浴箱，10ml

吸管，5ix1微量加樣器，已知抗體，標準抗原，待測抗原，電泳儀。

［實驗方法】

1）取一張玻璃片，用水沖洗干凈，再用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水

平臺備用。

2）將1%瓊脂糖融化，56℃水浴中保溫

3）取15ml瓊脂糖加到56℃預熱的玻璃管中，加入適量的抗體（約200ml）

充分混勻后平鋪于玻璃片上。

4）待凝膠凝固后打孔（直徑3mm）

5）將系列稀釋的標準抗原和待檢抗原分別加到凝膠孔中，每孔5lx1

6）在35v/cm電場中電泳30min。

7）根據(jù)標準稀釋抗原的峰高繪制標準曲線，計算待檢樣品的抗原含量。

【結果分析】

1）本實驗主要用于抗原的測定（只能測定Ug/ml以上的含量）。計算方法同

單向擴散，均需先根據(jù)系列稀釋的標準抗原的峰高作出標準曲線，然后在標準

曲線上找出待檢抗原對應的濃度。

2）可用于檢測血清免疫球蛋白或分泌型IgA及補體C3等的含量。

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3）一般來說，抗原應放在負極的一側，因為多數(shù)蛋白性抗原在堿性電泳緩沖

液中帶負電，在電場中向陽極運動。

五對流免疫電泳

【實驗原理】

當抗原和抗體在瓊脂介質中電泳時，抗體的PI比較高，在適當?shù)膒H值下，

抗體帶正電荷而抗原帶負電荷，故在電場中抗體向陰極方向移動而抗原向陽極

運動，直至相遇后形成沉淀線，其原理與雙向免疫擴散相同，但具有方法簡便,

快速及一次電泳可以檢測多個樣品等特點。

［實驗材料】

1%瓊脂糖，玻片或培養(yǎng)皿，凝膠打孔器（直徑3mm），水浴箱，5ul微量加

樣器，抗體，抗原，電泳儀，陽性對照血清，濾紙

［實驗方法】

1）取一張玻璃片，用水沖洗干凈后，再用少量75%乙醇沖洗，晾干后置于水

平臺備用。

2）1%瓊脂糖融化，56°C水浴中保溫

3）吸取瓊脂糖鋪于玻璃板上，厚約1.5mm）,制成所需膠板。

4）等待瓊脂糖凝固后，用打孔器成對打孔，孔徑3mm,孔間距3mm。排距

3nuuo

5）在孔中分別加入抗原和抗體，每孔5R1

6）在電場中電泳30分鐘（5v/cm）

7）觀察結果。在兩孔間出現(xiàn)沉淀線的為陽性。

［結果分析］

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本實驗是定性實驗，用于多種疾病的檢測，如HbsAg,AFP等的檢測，血吸

蟲，包蟲病等抗體的測定。

五免疫電泳

［原理］在凝膠介質中將區(qū)帶電泳法與免疫雙擴散相結合的一種免疫化學方

法。先使血清在瓊脂糖凝膠中電泳，在一定的電場強度下，由于血清中各種蛋

白質的分子大小及電荷狀態(tài)和電荷量不同，泳動速率也各不相同，使各自組分

得到分離，然后在電泳軸的平行方向挖一長槽，加入抗血清，抗原與相應抗體

擴散，相遇，出現(xiàn)沉淀弧線。

［材料］設瓊脂糖，玻片或培養(yǎng)皿，凝膠打孔器（直徑3mm）,水浴箱，5u

1微量加樣器，抗體，抗原，電泳儀，陽性對照血清，濾紙

［方法］

1）將玻璃板洗干凈，用75%乙醇沖洗，晾干備用

2）將1%瓊脂糖融化，56°C水浴中保溫備用

3）鋪板，打孔。

4）將凝膠孔加滿抗原，其中一孔加電泳指示劑。

5）將凝膠板放在電泳槽中進行電泳10v/cm,根據(jù)指示劑判定電泳時間。

6）電泳后在凝膠板上沿電泳方向平行挖2mm左右寬的長槽，其中加入抗血清

或特異性抗體。

7）將凝膠板轉入濕盒中，室溫放置12或18小時，可觀察到在一定位置出

現(xiàn)的沉淀弧線。

［結果與分析］

?臨床上常用于M蛋白血癥，確認該異常蛋白屬于哪一亞類免疫球蛋白，或哪

一型輕鏈。

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?鑒定蛋白質抗體，為單價抗體或多價抗體，如檢測多克隆丙種球蛋白血癥中

同時存在的高含量IgG,IgA和IgMo

?鑒定未知蛋白抗原（或抗體）。

免疫電泳示意圖

思考題

1免疫沉淀實驗中哪些可以用來檢測抗原，哪些用來檢測抗體？哪些是定性的,

哪些可以定量。

2免疫沉淀反應與凝集反應在應用方面有什么區(qū)別？

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實驗七補體結合反應

［原理］抗原與抗體結合形成的復合物能激活補體，若抗原是綿羊紅細胞，那

么補體被激活后，使綿羊紅細胞溶解，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。補體結合實驗是一種有

補體參與，并以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統(tǒng)的抗原抗體反應。參與本反

應的五種成分可分為兩個系統(tǒng)，一為待檢系統(tǒng)，即為已知抗原（或抗體）和待

檢抗體（或抗原）另一個為指示系統(tǒng)，即綿羊紅細胞和其相應的溶血素。待檢

抗原，抗體和先加入的補體作用后，再加入指示系統(tǒng)。若待檢系統(tǒng)中的抗原-抗

體相對應，兩者特異性結合后激活補體，再加入的指示系統(tǒng)無補體結合，不出

現(xiàn)溶血，是為補體結合實驗陽性；若待檢系統(tǒng)中的抗原與抗體不對應或缺少一

方，補體不被激活，當指示系統(tǒng)加入后，綿羊紅細胞-溶血素復合物激活補體,

產生溶血現(xiàn)象，是為補體結合實驗陰性。

本實驗敏感性，特異性均較高，可用于檢測某些病毒病，立克次體病，梅毒病

等。由于參與反應的各成分之間要求有適當?shù)牧康年P系，因此，做本實驗之前

必須通過一系列預備實驗來確定補體，溶血素，抗原或抗體的使用量。

［方法］

-）溶血素單位滴定

1材料：溶血素血清，抗原，2%綿羊紅細胞懸液，補體（1:30取豚鼠新鮮血

清），生理鹽水，小試管，吸管,37°C水浴箱。

2實驗過程

1）按表分別加入各種不同稀釋的溶血素0.2ml及其他成分。

2）充分混勻后置于37C水浴箱中30分鐘，然后觀察結果。

3）能呈現(xiàn)完全溶血的最高稀釋度的溶血素為1個單位

4）配制2個單位的溶血素溶液。

例如下表的結果表明，第11管（1:9600倍稀釋）中0.2ml溶血素為1個單位。實

驗室常用0.2ml中含2個溶血單位的稀釋液，即1:4800,配制時可以取1:100倍

稀釋的溶血素1ml加生理鹽水47ml。

例：溶血素的滴定表：

25

...........T落而莪612mi事…環(huán)布?T生理12%綿羊紅

試管號g

結果

c稀釋度I(1:30)鹽水|細胞

I1I1：1000I0.20.40.2,完全溶血

21：1200I0.20.40.2完全溶血

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