食品藥品化妝品微生物檢測概要

食品藥品化妝品微生物檢測概要4.培養(yǎng)基細(xì)菌：卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂第2頁,共39頁，2024年2月25日，星期天原理蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、和生長因子，氯化鈉維持均衡的滲透壓卵磷脂和吐溫80中和防腐劑并能子啊乳濁液中分散物質(zhì)的功能，卵磷脂能中和季銨鹽，吐溫80可中和酚、六氯酚、福爾馬林，兩者可中和乙醇，瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑大多數(shù)細(xì)菌能還原TTC,使之能易于形成辨別的紅色菌落，TTC能緩減某些雜菌生長。第3頁,共39頁，2024年2月25日，星期天霉菌：孟加拉紅培養(yǎng)基第4頁,共39頁，2024年2月25日，星期天原理

蛋白胨提供碳源和氮源；葡萄糖提供能源；磷酸二氫鉀為緩沖劑；硫酸鎂提供必須的微量元素；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；氯霉素可抑制細(xì)菌的生長；孟加拉紅作為選擇性抑菌劑可抑制細(xì)菌的生長，并可減緩某些霉菌因生長過快而導(dǎo)致菌落漫延生長。

第5頁,共39頁，2024年2月25日，星期天操作步驟不同類型樣品的檢樣制備。液體樣品：水溶性的液體樣品，可量取10ml加到90ml有玻璃珠滅菌生理鹽水中，如樣品不少于10ml。仍按10倍稀釋法進(jìn)行。如為5ml則加45ml滅菌生理鹽水，混勻后，制成1：10稀釋液。油性液體。取樣品10ml，先加5ml來菌液體石蠟混勻，再加10ml滅菌的吐溫80，在40~44℃水浴中振蕩混合10min，加入有玻璃珠滅菌的生理鹽水75ml（在44~44℃水浴中預(yù)溫），在40~44℃水浴中乳化，制成1：10的懸液。第6頁,共39頁，2024年2月25日，星期天膏、霜、乳劑半固體狀樣品。親水性的樣品，稱取10g，加到滅菌的帶玻璃珠加有90ml滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振蕩混勻，放32℃水浴靜置15min。用其上青液作為1：10的稀釋液。疏水性的樣品，稱取10g，放到滅菌的研缽中，加10ml滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加10ml滅菌吐溫80，研磨待溶解后，加70ml滅菌生理鹽水，在40~44℃水浴充分混合，制成1：10稀釋液。固體樣品，稱取10g，加到滅菌的生理鹽水稀釋瓶中，振蕩混勻，使其分散混懸后，放30~32℃水浴中，15min后取出，充分振蕩混合，再放到30~32℃水浴中靜置15min，取上清液作為1：10的稀釋液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g樣品加到90ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)1~2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品加到90MLSCDLP液體培養(yǎng)基，或1g樣品加1ml滅菌液體石蠟、1ml滅菌吐溫80、7ml滅菌生理鹽水，均質(zhì)3~5min。第7頁,共39頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌與霉菌圖鑒細(xì)菌霉菌第8頁,共39頁，2024年2月25日，星期天食品微生物限度檢查方法介紹食品微生物檢驗的指標(biāo)食品在食用前的各個環(huán)節(jié)中，被微生物污染往往是不可避免的。評價食品被微生物污染的程度，要采用微生物檢驗指標(biāo)采進(jìn)行。常采用的微生物檢驗指標(biāo)為三項細(xì)菌指標(biāo)，即細(xì)菌數(shù)量(主要是菌落總數(shù))、大腸菌群最近似數(shù)(MPN)和致病菌。第一節(jié)菌落總數(shù)

一、菌落總數(shù)的概念及衛(wèi)生意義食品中細(xì)菌數(shù)量越多，則食品腐敗變質(zhì)的速度就越快，甚至可引起食用者的不良王應(yīng)．如有人認(rèn)為細(xì)菌數(shù)量達(dá)到100—1000萬個／g時食品就可能引起食用者的食物中毒。菌落：指細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上生長繁殖而形成的能被肉眼識別的生長物，它是由數(shù)以萬計相同的細(xì)菌集合而成。細(xì)菌數(shù)量的表示方法由于所采用的計數(shù)方法不同而有兩種：菌落總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)：第9頁,共39頁，2024年2月25日，星期天1、菌落總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品樣品，在一定條件下進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，使每一個活菌只能形成一個肉眼可見的菌落，然后進(jìn)行菌落計數(shù)所得的菌落數(shù)量。通常以lg或1ml或lcm2樣品中所含的菌落數(shù)量來表示。按國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定，即在需氧情況下，37℃培養(yǎng)48h，能在普通營養(yǎng)瓊脂平板上生長的細(xì)菌菌落總數(shù)，所以厭氧或微需氧菌、有特殊營養(yǎng)要求的以及非嗜中溫的細(xì)菌，由于現(xiàn)有條件不能滿足其生理需求，故難以繁殖生長。因此菌落總數(shù)并不表示實際中的所有細(xì)菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細(xì)菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。

第10頁,共39頁，2024年2月25日，星期天02、細(xì)菌總數(shù)指一定數(shù)量或面積的食品樣品．經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚砗?，在顯微鏡下對細(xì)菌進(jìn)行直接計數(shù)。其中包括各種活菌數(shù)和尚未消失的死菌數(shù)。細(xì)菌總數(shù)也稱細(xì)菌直接顯微鏡數(shù)。通常以1g或1m1或lcm2—樣品中的細(xì)菌總數(shù)來表示。菌落總數(shù)測定是用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，它反映食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求，以便對被檢樣品做出適當(dāng)?shù)男l(wèi)生學(xué)評價。菌落總數(shù)的多少在一定程度上標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣

二、菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗方法菌落總數(shù)的常規(guī)檢驗方法(GB4789．2-84)：一般將被檢樣品制成幾個不同的10倍遞增稀釋液，然后從每個稀釋液中分別取出1mL置于滅菌平皿中與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基混合，在一定溫度下，培養(yǎng)一定時間后（一般為48小時），記錄每個平皿中形成的菌落數(shù)量，依據(jù)稀釋倍數(shù)，計算出每克（或每ml）原始樣品中所含細(xì)菌菌落總數(shù)?；静僮饕话惆ǎ簶悠返南♂尅獌A注平皿——培養(yǎng)48（24）小時——計數(shù)報告第11頁,共39頁，2024年2月25日，星期天（一）樣品的處理和稀釋：1．操作方法：1）、以無菌操作取檢樣25g（或25ml)，放于225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振要或研磨制成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000~10000r/min的速度處理1min，制成1：10的均勻稀釋液。2）、用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混合均勻，制成1：100的稀釋液。3）、另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管。

第12頁,共39頁，2024年2月25日，星期天2．無菌操作：操作中必須有“無菌操作”的概念，所用玻璃器皿必須是完全滅菌的。所用剪刀、鑷子等器具也必須進(jìn)行消毒處理。樣品如果有包裝，應(yīng)用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。操作應(yīng)當(dāng)在超凈工作臺或經(jīng)過消毒處理的無菌室進(jìn)行。瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。

3．采樣的代表性：如系固體樣品，取樣時不應(yīng)集中一點，宜多采幾個部位。固體樣品必須經(jīng)過均質(zhì)或研磨，液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。

4．稀釋液：樣品稀釋液主要是滅菌生理鹽水，有的采用磷酸鹽緩沖液（或0.1％蛋白胨水），后者對食品已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。如對含鹽量較高的食品（如醬油）進(jìn)行稀釋，可以采用滅菌蒸餾水。第13頁,共39頁，2024年2月25日，星期天操作簡介示意圖第14頁,共39頁，2024年2月25日，星期天食品細(xì)菌培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂：用于藥品和藥品中細(xì)菌總數(shù)計數(shù)

第15頁,共39頁，2024年2月25日，星期天霉菌培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂：馬鈴薯浸出粉有助于霉菌生長，葡萄糖提供能源，營養(yǎng)瓊脂提供凝固劑，氯霉素抑制細(xì)菌的生長第16頁,共39頁，2024年2月25日，星期天食品中不得檢測出的細(xì)菌和霉菌細(xì)菌包括沙門氏菌,志賀氏菌，致謝大腸埃希氏菌等霉菌包括黃曲霉、寄生曲霉、雜色曲霉等第17頁,共39頁，2024年2月25日，星期天藥品微生物限度檢查方法介紹第18頁,共39頁，2024年2月25日，星期天微生物限度檢查法：檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標(biāo)，也是對生產(chǎn)企業(yè)的設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù)之一。藥品的生產(chǎn)、貯存、銷售過程中的檢驗，原料及輔料的檢驗，新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂，進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核，考察藥品質(zhì)量及仲裁等，除另有規(guī)定外，其微生物限度檢查均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。第19頁,共39頁，2024年2月25日，星期天檢查項目細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌的檢查。第20頁,共39頁，2024年2月25日，星期天檢測藥品種類1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標(biāo)示無菌的制劑應(yīng)符合無菌檢查法的規(guī)定。2、口服給藥制劑3、局部給藥制劑

3.1.用于手術(shù)、燒傷及嚴(yán)重?fù)p傷的局部給藥制劑無菌

3.2.眼部給藥制劑：

3.3、耳、鼻及呼吸道吸入給藥制劑

3.4、陰道、尿道給藥制劑

3.5、直腸給藥制劑

3.6、其它局部給藥4、含動物組織（包括提取物）的口服給藥制劑5、有兼用途徑的制劑應(yīng)符合各給藥途徑的標(biāo)準(zhǔn)6、霉變、長螨者以不合格論7、原料及輔料第21頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試品的抽樣及檢驗取量一般采用隨機(jī)抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗用量的3倍量（以備復(fù)試）。貴重藥品檢驗量可以酌減（至少要夠各種菌檢查用的溶液）。所有劑型的檢驗量均需取2個以上包裝單位（中藥密丸、膜劑，需取自4丸、4片以上）。固體及半固體（粘稠性供試品）制劑檢驗量為10g。液體制劑檢驗量為10ml。膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為50m2,化學(xué)藥及生化藥膜劑檢查量為10cm2。抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠?，應(yīng)選取有疑問的樣品，但明顯破裂的包裝不得作為樣品。凡能從藥品、瓶口（外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍）外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品，可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗。第22頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試品的保存供試品在檢驗之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死或繁殖。供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴(yán)禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。第23頁,共39頁，2024年2月25日，星期天平板菌落計數(shù)法供試液制備（10倍遞增稀釋）注平皿倒培養(yǎng)基搖合（45℃營養(yǎng)瓊脂玫瑰紅鈉瓊脂

YPD瓊脂培養(yǎng)基）倒置培養(yǎng)（30～35℃48小時；25～28℃72小時）菌落點數(shù)（30～300個30～100個）菌數(shù)報告（10條原則）第24頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的制備（1）乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)證明是有效的，并對微生物無毒性。水浴加溫時，溫度不超過45℃，時間不超過30分鐘。供試液從制備到加入培養(yǎng)基，不超過1小時。供試液的體積：最終體積為100ml。第25頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的制備（2）稀釋劑：

pH7.0氯化鈉－蛋白胨緩沖液腸溶制劑

pH7.6磷酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液非水溶性供試品乳化劑：5g司盤80、3g單硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的無菌混合物（事先配制好、滅菌消毒）。十四烷酸異丙酯萃取或過濾第26頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的制備（3）液體供試品取供試品10ml，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑至100ml，搖勻，作為1:10供試液。含王漿或蜂蜜的液體制劑和滴眼劑直接用供試品作為供試液。固體、半固體或粘稠供試品，稱取供試品10g，置于勻漿杯或適當(dāng)滅菌容器中，加入稀釋劑至100ml，用勻漿儀（3000-5000r/，2—4min）、振蕩器或乳缽研磨等方法混勻。胃溶膠囊加稀釋劑后置45℃±1℃水浴振搖，腸溶膠囊加無菌磷酸鹽緩沖液后45℃±1℃水浴振搖。第27頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的制備（4）非水溶液性供試品軟膏劑、乳膏劑、稱供試品5g（5ml），加到含已滅菌溶化并45℃保溫的乳化劑的燒杯中，用無菌玻棒攪拌混勻后，慢慢加入45℃左右的稀釋劑85ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作供試液（1:20）。油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯—805–8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。栓劑，稱取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑，置45℃水浴保溫10min，使溶，加入滅菌聚山梨酯805—8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑（稀釋劑和聚山梨酯80總量為100ml），搖勻。第28頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的制備（5）氣霧劑，將供試品置冰箱（4--8℃）1h，取出，用碘伏棉球（也可用乙醇棉球）擦拭試品開啟部位周圍，然后以無菌鋼錐鉆孔并插入容器中，勿移出鋼錐，以轉(zhuǎn)動方式使容器拋射劑全部拋出。以無菌注射器吸出全部溶液，按標(biāo)示量補(bǔ)加稀釋劑至足量（若含非水溶性成分，加適量無菌聚山梨酯—80液）此液即為供試品原液。膜劑將藥膜剪成碎片，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑至100ml，于45℃±1℃水浴中保溫，振搖使溶。茶劑，取供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑至100ml，振搖30s,以滅菌紗布過濾，（如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min）。以上供試品如吸水膨脹，或粘度過高，可增加稀釋劑，制成1:20—1:100供試液。

第29頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試品溶液的制備（6）（含抑菌成分的供試品）稀釋法：10ml供試液種入較大體積的培養(yǎng)基中，一般不超過1000ml

離心沉淀法：3000rpm，30min，底部2ml稀釋至10ml。500rpm,5min，上清液再離心集菌薄膜過濾法：0.45um的濾膜，沖洗3次，每次至少100ml

中和法：磺胺類100ml增菌液中含1%的對氨基苯甲酸1ml

砷、汞類100ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基洗必泰類100ml增菌液中加適量的聚山梨酸80等表面活性劑沉降法：自然沉降5min，取上層液置100ml增菌液中第30頁,共39頁，2024年2月25日，星期天供試液的稀釋（10倍遞增稀釋法）10g100ml1:101ml10ml1:1001ml10ml1:1000至少3個稀釋級，每遞增1個稀釋級，必須更換吸管。管內(nèi)混合吹打不少于10次，吸液在液面下2.5cm處，放液在液面上1cm處，延內(nèi)壁緩緩吹出全部溶液，然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。第31頁,共39頁，2024年2月25日，星期天注平皿在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各種稀釋液各1ml至每個滅菌平皿中（從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸管），每一稀釋級注2-3個平皿（此時一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管），注平皿時，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部。同時作陰性對照（待各級稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管取稀釋劑各1ml，分別注入4個平皿中。其中2個作細(xì)菌數(shù)陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，則再增加2個平皿作酵母菌數(shù)陰性對照。

第32頁,共39頁，2024年2月25日，星期天倒培養(yǎng)基搖合將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基（細(xì)菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂、霉菌、酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜、王漿液體制劑另用YPD瓊脂）熔化、冷至約45℃時，傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混勻，注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基，濺到皿邊及皿蓋上，置操作臺上待凝。第33頁,共39頁，2024年2月25日，星期天倒置培養(yǎng)