DB32T3683-2019豬鏈球菌9型PCR檢測技術規(guī)程

ICS11.220

B41DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3683—2019

豬鏈球菌9型PCR檢測技術規(guī)程

TechnicalregulationforPCRdetectingStreptococcussuisSerotype9

2019-12-03發(fā)布2019-12-25實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3683—2019

豬鏈球菌9型PCR檢測技術規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了豬鏈球菌9型PCR檢測技術所用的儀器設備和主要試劑、引物、方法步驟、結果判定、

廢棄物處理和防止污染的措施等要求。

本標準適用于豬鏈球菌9型的PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》（農醫(yī)發(fā)〔2017〕25號）

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

豬鏈球菌9型Streptococcussuisserotype9

屬于鏈球菌屬的一種細菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1-31、33及1/2共33個血清型。豬

鏈球菌9型是豬鏈球菌的一個血清型，不僅對豬致病性很強，而且可以感染特定的人群，是一種人獸共

患病病原菌。

4儀器設備和主要試劑

4.1儀器設備

高速離心機、水浴鍋、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

4.2主要試劑

生理鹽水、超純水、蛋白酶K、2×PCRMix、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）。

5引物

5.1上游引物：5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′。

5.2下游引物：5′-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3′。

6方法步驟

6.1樣品處理

6.1.1病料樣品處理

1

DB32/T3683—2019

采用差速離心法，取約5g病料（肝或肺或腦組織），剪碎研磨，用5mL生理鹽水混懸，先2000

r/min離心2min，去除大組織塊，取上清液，后10000r/min離心5min，棄上清液，沉淀以200μL超

純水重懸，備用。

6.1.2待檢培養(yǎng)物樣品處理

取待檢液體培養(yǎng)物（純培養(yǎng)物或混合培養(yǎng)物）1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL

超純水重懸，備用。陰性對照：THB培養(yǎng)基。陽性對照：豬鏈球菌9型標準菌株（22083）的THB培

養(yǎng)物。陰性、陽性對照也同樣處理，對每個樣品進行編號標記。

6.2DNA提取

取6.1獲得的樣品及對照，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，

10000r／min離心5min，上清作為模板DNA。

6.3PCR擴增

6.3.1反應條件

按25μL體系進行，2×PCRMix12.5μL，上游引物（10pmol/μL）1.0μL，下游引物（10pmol/μL）

1.0μL，模板DNA2.0μL，超純水8.5μL。按如下條件進行PCR反應。95℃5min，然后進入循環(huán)94℃

30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。

6.3.2電泳

將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間30min。

6.3.3結果觀察

用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，并進行拍照。

7結果判定

7.1檢測結果成立條件

陽性對照的PCR產物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對照PCR產物電泳后沒有

條帶（見附錄A），檢測結果成立；否則，結果不成立。

7.2結果判定

7.2.1在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條

帶，判為陽性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陽性。

7.2.2在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性

條帶，判為陰性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陰性。

7.2.3如果陽性對照無相應的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測需要重復進行；如果陰性對照有

相應的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該檢測需要重復進行。

8廢棄物處理和防止污染的措施

檢測過程中的廢棄物，應做好無害化處理。檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄B。

2

DB32/T3683—2019

附錄A

(資料性附錄)

豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖

M12

2000bp——

1000bp——

750bp——

500bp——

——389bp

250bp——

100bp——

M——DNA分子量標準（DL2000Marker）；

1——陽性對照；

2——陰性對照。

圖A.1豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖

3

DB32/T3683—2019

附錄B

(規(guī)范性附錄)

檢測過程中防止交叉污染的措施

B.1抽樣和制樣過程

抽樣和制樣工具，應清洗干凈，121℃，15min～20min滅菌，一套清潔工具限于一個樣品使用。

存放樣品的容器應該經過清洗、滅菌，或為一次性滅菌容器。

B.2檢測過程

B.2.1PCR實驗室應分為樣品制備區(qū)、前PCR區(qū)、PCR區(qū)、后PCR區(qū)。將模板提取、PCR反應液配制、

PCR循環(huán)擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行。實驗室的運作應從“凈區(qū)”到“臟區(qū)”單方向進

行。

B.2.2實驗過程中，應穿實驗服和戴手套，手套要經常更換。各區(qū)要有專用實驗服，經常清洗。

B.2.3各區(qū)所有的試劑、器材(尤其是移液器)、儀器都應專用，不得帶出該區(qū)。

B.2.4所有溶液、水、耗材和器具要121℃，15min～20min滅菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每種

溶液應使用高質量的成分和超純水。所有試劑應該以大體積配制，然后分裝成僅夠一次使用的量進行貯

存。

B.2.5裝有DNA模板或引物的離心管打開之前，要簡短離心，離心管不能用力崩開，以免產生氣溶膠。

B.2.6前PCR區(qū)中，在PCR操作箱中加人PCR反應各組分。

B.2.7實驗前后，實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA。

_________________________

4

DB32/T3683—2019

前言

本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準由江蘇省農業(yè)科學院提出并歸口。

本標準起草單位：江蘇省農業(yè)科學院。

本標準主要起草人：倪艷秀、何孔旺、周俊明、祝昊丹、呂立新、俞正玉、王丹丹、張雪寒、溫立

斌、李彬。

I

DB32/T3683—2019

豬鏈球菌9型PCR檢測技術規(guī)程

1范圍

本標準規(guī)定了豬鏈球菌9型PCR檢測技術所用的儀器設備和主要試劑、引物、方法步驟、結果判定、

廢棄物處理和防止污染的措施等要求。

本標準適用于豬鏈球菌9型的PCR檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范

《病死及病害動物無害化處理技術規(guī)范》（農醫(yī)發(fā)〔2017〕25號）

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

豬鏈球菌9型Streptococcussuisserotype9

屬于鏈球菌屬的一種細菌，根據(jù)其莢膜多糖抗原的差異，可分為1-31、33及1/2共33個血清型。豬

鏈球菌9型是豬鏈球菌的一個血清型，不僅對豬致病性很強，而且可以感染特定的人群，是一種人獸共

患病病原菌。

4儀器設備和主要試劑

4.1儀器設備

高速離心機、水浴鍋、PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

4.2主要試劑

生理鹽水、超純水、蛋白酶K、2×PCRMix、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）。

5引物

5.1上游引物：5′-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3′。

5.2下游引物：5′-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3′。

6方法步驟

6.1樣品處理

6.1.1病料樣品處理

1

DB32/T3683—2019

采用差速離心法，取約5g病料（肝或肺或腦組織），剪碎研磨，用5mL生理鹽水混懸，先2000

r/min離心2min，去除大組織塊，取上清液，后10000r/min離心5min，棄上清液，沉淀以200μL超

純水重懸，備用。

6.1.2待檢培養(yǎng)物樣品處理

取待檢液體培養(yǎng)物（純培養(yǎng)物或混合培養(yǎng)物）1mL10000r/min離心5min，棄上清，沉淀以200μL

超純水重懸，備用。陰性對照：THB培養(yǎng)基。陽性對照：豬鏈球菌9型標準菌株（22083）的THB培

養(yǎng)物。陰性、陽性對照也同樣處理，對每個樣品進行編號標記。

6.2DNA提取

取6.1獲得的樣品及對照，每200μL加入3μL蛋白酶K（20mg/mL），42℃作用1h，煮沸5min，

10000r／min離心5min，上清作為模板DNA。

6.3PCR擴增

6.3.1反應條件

按25μL體系進行，2×PCRMix12.5μL，上游引物（10pmol/μL）1.0μL，下游引物（10pmol/μL）

1.0μL，模板DNA2.0μL，超純水8.5μL。按如下條件進行PCR反應。95℃5min，然后進入循環(huán)94℃

30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個循環(huán)，于72℃延伸10min，4℃保存。

6.3.2電泳

將PCR反應產物于1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓為120V，時間30min。

6.3.3結果觀察

用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果，并進行拍照。

7結果判定

7.1檢測結果成立條件

陽性對照的PCR產物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，陰性對照PCR產物電泳后沒有

條帶（見附錄A），檢測結果成立；否則，結果不成立。

7.2結果判定

7.2.1在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條

帶，判為陽性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陽性。

7.2.2在檢測結果成立的前提下，如果檢測樣品中PCR產物電泳后在389bp的位置上未出現(xiàn)一條特異性

條帶，判為陰性，即該樣品為豬鏈球菌9型核酸陰性。

7.2.3如果陽性對照無相應的目的條帶，可能是存在操作失誤，該檢測需要重復進行；如果陰性對照有

相應的目的條帶，可能是陰性對照存在污染或是操作失誤，該檢測需要重復進行。

8廢棄物處理和防止污染的措施

檢測過程中的廢棄物，應做好無害化處理。檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄B。

2

DB32/T3683—2019

附錄A

(資料性附錄)

豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖

M12

2000bp——

1000bp——

750bp——

500bp——

——389bp

250bp——

100bp——

M——DNA分子量標準（DL2000Marker）；

1——陽性對照；

2——陰性對照。

圖A.1豬鏈球菌9型PCR產物電泳圖