DB32T3788-2020梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020

B16

DB32

江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB32/T3788—2020

梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

TechnicalspecificationformonitoringanddetectionofShootBlightofAsianpear

2020-04-08發(fā)布2020-05-15實(shí)施

江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的原理、試劑與材料、儀器與用具、監(jiān)測(cè)技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、結(jié)果

判定和報(bào)告、樣品、菌種保藏和無(wú)害化處理、疫情處置等要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于梨枯梢病田間監(jiān)測(cè)以及苗木、砧木、接穗和果實(shí)上傳帶的梨枯梢病菌的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T2292亞洲梨火疫病監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

SN/T1157進(jìn)出境植物苗木檢疫規(guī)程

SN/T1193基因分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3原理

梨枯梢病，病原為亞洲梨火疫病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.），是為害梨樹的重要細(xì)菌病害之

一，屬我國(guó)規(guī)定的檢疫性有害生物?？梢愿鶕?jù)田間癥狀、菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征、致病性、免疫學(xué)反應(yīng)和

分子生物學(xué)特征等進(jìn)行監(jiān)測(cè)與檢測(cè)。

4試劑與材料

檢測(cè)中所需的所有試劑與培養(yǎng)基，參見附錄A。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。

5儀器與用具

超凈工作臺(tái)、電子天平、磁力攪拌器、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、水浴鍋、顯微鏡、高速臺(tái)式離心機(jī)、

電泳儀、常規(guī)PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、冰箱、超低溫冰箱、超純水器、恒溫干燥箱、恒溫?fù)u床、微量移

液器、制冰機(jī)等。

6監(jiān)測(cè)技術(shù)

6.1監(jiān)測(cè)植物

梨，主要監(jiān)測(cè)亞洲梨。

1

6.2監(jiān)測(cè)區(qū)域

重點(diǎn)監(jiān)測(cè)亞洲梨集中種植區(qū)、引種繁育基地、苗木集散地等疫情發(fā)生高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)。

6.3監(jiān)測(cè)方法

6.3.1苗木監(jiān)測(cè)

對(duì)從疫情發(fā)生區(qū)調(diào)運(yùn)的苗木或疫區(qū)市場(chǎng)銷售的苗木，按照SN/T1157要求進(jìn)行抽樣，并對(duì)樣品進(jìn)行

室內(nèi)檢測(cè)。

6.3.2田間監(jiān)測(cè)

從梨樹開花期開始，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)技員、果農(nóng)等相關(guān)人員進(jìn)行訪問(wèn)調(diào)查，并選擇有代表性的梨園進(jìn)行踏

查。重點(diǎn)觀察田間有無(wú)梨枯梢病典型癥狀（見附錄B），如發(fā)現(xiàn)可疑病株立刻進(jìn)行標(biāo)記、拍照并取樣，

樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)鑒定。對(duì)梨園中梨枯梢疑似癥狀及其發(fā)生地點(diǎn)、發(fā)生時(shí)間、危害情況等信

息進(jìn)行記錄（見附錄C）。

在疫情發(fā)生區(qū)，選擇有代表性的梨園進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測(cè)。從梨樹開花期開始，每隔7d調(diào)查一次。采用5

點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查5株，統(tǒng)計(jì)或計(jì)算病株率和病梢率，并做好相關(guān)記錄。監(jiān)測(cè)過(guò)程中病梢的選取

按照NY/T2292中的規(guī)定執(zhí)行。

7檢測(cè)技術(shù)

7.1樣品處理

選擇表現(xiàn)典型癥狀并帶有菌膿的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、葉片或幼果等，在無(wú)菌條件下切取

病健交界處組織約（3mm～5mm）×（3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在裝有適量無(wú)菌水的離心

管中輕輕擠壓，浸泡10min～30min后制成樣品懸浮液。或者直接挑取菌膿并用無(wú)菌水清洗后制成樣品

懸浮液。懸浮液可用于其后的形態(tài)觀察、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)等。

7.2檢測(cè)方法

7.2.1顯微鏡檢查

對(duì)于疑似癥狀的植物組織，切取病健交界處20mm2，平放在載玻片的水滴中，加蓋玻片后，在低

倍顯微鏡下觀察有無(wú)噴菌現(xiàn)象。

7.2.2培養(yǎng)特征檢測(cè)

將樣品懸浮液在YPDA培養(yǎng)基平板上劃線或稀釋分離，28℃倒置培養(yǎng)24h～72h。在YPDA培養(yǎng)基平

板上觀察分離得到的細(xì)菌單菌落的形狀、大小、顏色、光澤、隆起的形狀、粘稠度、透明度、邊緣特征

以及質(zhì)地、水溶性色素等特征，觀察并進(jìn)行記錄（參見附錄B）。

7.2.3形態(tài)特征檢測(cè)

按照常規(guī)染色方法，在顯微鏡下觀察細(xì)菌菌體的形狀、大小及排列情況、有無(wú)鞭毛及鞭毛著生的位

置和數(shù)目、是否產(chǎn)生莢膜和芽胞、芽胞著生的部位和形狀、細(xì)胞內(nèi)含物等特征。

7.2.4致病性測(cè)定

2

取梨幼果（直徑大約3cm～5cm）洗凈晾干，用滅菌刀片橫切果實(shí)，置于墊有濕潤(rùn)的滅菌濾紙的培

養(yǎng)皿中。用無(wú)菌接種針蘸取培養(yǎng)24h～36h的菌落，針刺接種于幼果果肉組織，一個(gè)橫切面接種3個(gè)～4

個(gè)點(diǎn)。接種后26℃保濕培養(yǎng)，24h后觀察并記錄接種部位有無(wú)壞死癥狀發(fā)生和菌膿形成。以無(wú)菌水為對(duì)

照。

7.2.5ELISA檢測(cè)

挑取少量分離到的病原菌配制成108CFU/mL懸浮液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)程序參見附錄D。如采用

商品化ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

7.2.6PCR檢測(cè)

挑取少量分離到的病原菌配制成108CFU/mL懸浮液，1mL菌懸液提取DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)

程序見附錄E。如采用市售的試劑盒，按說(shuō)明操作。檢測(cè)過(guò)程中防污染措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。

8結(jié)果判定和報(bào)告

8.1結(jié)果判定

8.1.1癥狀識(shí)別判定

田間梨樹發(fā)病癥狀符合附錄B描述的梨枯梢病典型癥狀，判斷為梨枯梢病。

8.1.2常規(guī)檢測(cè)結(jié)果判定

鏡檢有菌溢現(xiàn)象；分離物形態(tài)特征和培養(yǎng)特性與梨枯梢病菌相符（參見附錄B）；致病性測(cè)定可在

接種部位產(chǎn)生高度隆起的乳白色菌膿，最后組織變褐壞死，但不發(fā)臭；能再次從接種發(fā)病部位分離到目

標(biāo)病原菌，確定病原菌為梨枯梢病菌。

8.1.3ELISA檢測(cè)結(jié)果判定

在陰性對(duì)照OD值≤0.1，且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性

對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶有梨枯梢病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶梨枯梢

病菌。

8.1.4PCR檢測(cè)結(jié)果判定

觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照在476bp處有條帶出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)條帶，待測(cè)樣品在476bp處有條帶

出現(xiàn)，判斷樣品中含有梨枯梢病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品中不帶梨枯梢病菌。

8.2結(jié)果報(bào)告

8.2.1監(jiān)測(cè)報(bào)告

記錄監(jiān)測(cè)結(jié)果并填寫《疫情監(jiān)測(cè)記錄表》（見附錄C）。對(duì)監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行整理匯總，形成監(jiān)測(cè)報(bào)告。

8.2.2檢測(cè)報(bào)告

將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)鑒定結(jié)果填入《植物有害生物樣本檢測(cè)報(bào)告》（見附錄F）。

3

9樣品、菌種保藏和無(wú)害化處理

9.1樣品保藏

未發(fā)現(xiàn)梨枯梢病的樣品保藏6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)梨枯梢病的樣品保藏1年，有貿(mào)易糾紛的樣品保藏至少1年，

以備復(fù)驗(yàn)，如涉及到貿(mào)易糾紛則應(yīng)保藏到糾紛解決完畢。保藏樣品要標(biāo)明樣品編號(hào)、樣品名稱、保藏人、

保藏日期和到期日期。樣品保藏期滿后，需經(jīng)滅活銷毀處理。

9.2菌種保藏

分離得到的梨枯梢病菌菌株應(yīng)妥善保存，防止擴(kuò)散。

9.3無(wú)害化處理

監(jiān)測(cè)和檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的有關(guān)材料和用具，在使用完畢后須及時(shí)進(jìn)行滅活銷毀處理。

10疫情處置

經(jīng)監(jiān)測(cè)或室內(nèi)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)梨枯梢病，應(yīng)指導(dǎo)生產(chǎn)、銷售和個(gè)人實(shí)施檢疫處治及病害防治。

4

AA

附錄A

（資料性附錄）

試劑及培養(yǎng)基的配制方法

A.1ELISA檢測(cè)

A.1.1包被液

Na2HCO32.93g、NaCl1.59g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到9.6，定容至1000mL。

A.1.2洗滌液

Na2HPO4·12H2O3.58g、KCl0.2g、KH2PO40.27g、NaCl8.01g、吐溫-200.5g，用蒸餾水溶解，調(diào)

整pH值到7.4，定容至1000mL。

A.1.3樣品提取液

Na2HPO4·12H2O3.58g、KCl0.2g、KH2PO40.27g、NaCl8.01g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到7.4，

定容至1000mL。

A.1.4封閉液

脫脂奶粉5g，溶解于100mL樣品提取液。

A.1.5抗體稀釋液

脫脂奶粉2.5g，溶解于100mL洗滌液。

A.1.6TMB顯色液

A.1.6.1底物緩沖液

Na2HPO4·12H2O2.375g、檸檬酸1.1675g，用蒸餾水溶解，調(diào)整pH值到5.0，定容至250mL。

A.1.6.2TMB母液

10mgTMB溶于1mL二甲亞砜（DMSO）中，4℃保存。

A.1.6.30.75%H2O2

取25μL30%H2O2用超純水定容到1mL，4℃避光保存。

A.1.6.4顯色液

配置：在10mL底物緩沖液加入100μLTMB母液和32μL0.75%H2O2混勻后使用，需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

A.1.7終止液

濃硫酸11.1mL，用蒸餾水定容到100mL。

5

A.2PCR檢測(cè)

A.2.1電泳緩沖液TBE

Tris堿54g、硼酸27.5g、0.5MEDTA（pH8.0）20mL，用蒸餾水溶解定容至1000mL。使用時(shí)利

用蒸餾水10倍稀釋，即為0.5×TBE。

A.2.2瓊脂糖凝膠

在0.5×TBE工作液中加入1%(w/v)的瓊脂糖，加熱融化，冷卻至60℃倒入插入梳子的制膠槽中，冷

卻凝固后點(diǎn)樣電泳。

A.2.3上樣緩沖液

溴百里酚藍(lán)0.025g，乙二醇3g，溶解于10mL蒸餾水。

A.3YPDA培養(yǎng)基

A液：聚蛋白胨20g，酵母提取物10g，溶解于850mL水中，121℃濕熱滅菌20min；

B液：葡萄糖20g，溶解于100mL水中，115℃濕熱滅菌15min；

C液：腺嘌呤硫酸鹽20mg，溶解于10mL水中，115℃濕熱滅菌15min；

將A、B、C三種溶液混合，用無(wú)菌水定容至1000mL。

如制作平板，在A溶液中加入15g瓊脂粉。

6

BB

附錄B

（資料性附錄）

梨枯梢病基本信息

B.1分類地位

梨枯梢病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.）屬于細(xì)菌界（Bacteria）、變形菌門（Proteobacteria），

γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae），

歐文氏菌屬（Erwinia），在亞洲梨（Nashipear，Pyruspyrifolia）引起梨枯梢病，為亞洲梨樹上的重要

檢疫性病害。

B.2形態(tài)特征

革蘭氏陰性菌，周生鞭毛，短桿狀，兼性厭氧。菌體大小為0.8μm×（1.0μm～3.0μm），以單個(gè)、

成對(duì)或短鏈形式存在。

B.3生物學(xué)特性

病菌最適生長(zhǎng)溫度25℃～27.5℃。在YPDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48h后，菌落大小直徑為2mm，呈圓

形、白色、凸起、不透明。

B.4發(fā)病規(guī)律

病原菌在病樹上越冬。翌年春天在潮濕環(huán)境中，病原菌活躍繁殖，可以通過(guò)蜜蜂、螞蟻等昆蟲粘帶

傳播，也可以通過(guò)雨水飛濺傳播。病原菌通過(guò)花器、自然孔口（皮孔、氣孔）或傷口侵入，在嫩枝中的

胞間或者導(dǎo)管中擴(kuò)散。

B.5田間癥狀特征

B.5.1花簇與嫩枝

花簇上的癥狀一般在花瓣脫落1周～2周后表現(xiàn)?；ㄆ鞅缓蟪饰锠?，深褐色，并向下蔓延至花

柄，使花柄呈水漬狀，然后皺縮變成黑褐色，脫落或干枯后仍懸掛在樹枝上，花梗上有橘紅色菌膿滲出。

嫩枝的癥狀與花期相似，但病害發(fā)展更快。嫩枝尖可迅速枯萎形成“牧羊鞭”狀。感病葉片常發(fā)黑沿中

脈擴(kuò)展至完全壞死。許多患病的嫩芽、梢和樹葉，使一棵樹看似被燒焦，枯萎。

B.5.2樹干與枝條

新枝皮色變黑，水漬狀，枝尖萎蔫下彎，呈“牧羊鞭”狀；多年生枝中部皮層凹陷向前向后蔓延，

造成大枝、中心干整枝或整株死亡；枝條、骨干枝和主干表皮流出銹紅色液體；撥開皮層韌皮、木質(zhì)部

組織呈黃褐色。

7

B.5.3葉片

沿主脈或沿葉邊緣及兩脈之間形成黑褐色的病斑。隨著變色加深，葉片卷曲萎縮下垂，干枯掛在枝

上不脫落，葉柄變黑，葉柄上有桔紅色菌濃。

B.5.4果實(shí)

未成熟的果實(shí)受侵染時(shí)出現(xiàn)水漬狀，然后呈褐色收縮，逐漸變黑，受侵染果實(shí)不易脫落。幼果出現(xiàn)

黑色斑點(diǎn)、斑塊，局部或整個(gè)表皮先變黑，后延伸至果肉，果柄通常有菌膿；果實(shí)生長(zhǎng)期間一直不斷隨

枝發(fā)病萎焉皺縮掛在樹上失去商品性。

8

CC

附錄C

（規(guī)范性附錄）

疫情監(jiān)測(cè)記錄表

調(diào)查單位：調(diào)查時(shí)間：

編號(hào)作物品種調(diào)查地點(diǎn)調(diào)查株數(shù)疑似癥狀表現(xiàn)株數(shù)監(jiān)測(cè)結(jié)果

調(diào)查人（簽字）：

9

DD

附錄D

（資料性附錄）

梨枯梢病菌雙抗ELISA檢測(cè)程序

D.1包被

捕獲抗體提前按照市售產(chǎn)品要求用包被液進(jìn)行稀釋，然后每孔加入100μL包被于96孔酶標(biāo)板上。4℃

孵育12h～16h后棄去孔中液體，用洗滌液加滿每個(gè)反應(yīng)孔，靜置1min～2min后，將洗滌液緩慢倒出，

重新加入新的洗滌液，重復(fù)上述步驟3次。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中

的水分。

D.2封閉

酶標(biāo)板中每孔加入200μL封閉液，37℃封閉1.5h后棄去封閉液，用洗滌液洗板3次，每次2min。洗

板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。

D.3加樣

加入梯度稀釋的梨枯梢病菌菌液，每孔100μL。室溫孵育1h后棄去孔中液體，用洗滌液洗板4次，

每次2min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，吸干反應(yīng)孔中的水分。

D.4加酶標(biāo)檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物

每孔加入100μL檢測(cè)抗體-HRP復(fù)合物，抗體HRP復(fù)合物提前按照市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，置于保

濕容器中，25℃孵育1h。用洗滌液洗板4次，每次2min。洗板完成后將酶標(biāo)板倒置于干凈的吸水紙上，

吸干反應(yīng)孔中的水分。

D.5顯色

提前15min配好顯色液，每孔加入100μL，25℃避光顯色20min至陽(yáng)性對(duì)照顯色。

D.6終止反應(yīng)

顯色后在每孔加入50μL終止液。

D.7測(cè)定

在波長(zhǎng)450nm下用酶標(biāo)儀測(cè)量結(jié)果，讀取各孔溶液的光密度值（OD值），記錄結(jié)果。

10

EE

附錄E

（資料性附錄）

梨枯梢病菌PCR檢測(cè)程序

E.1DNA提取

挑取少量分離到的病原菌配制成108CFU/mL懸浮液，1mL菌懸液按照市售DNA提取試劑盒要求提

取DNA。提取后用蛋白/核酸分析儀鑒定DNA質(zhì)量，當(dāng)A260/A280比值為1.8～2.0時(shí)，適合于PCR擴(kuò)增。

E.2引物

上游引物（HrcCF）:5’-GACGTTTGCACCTGGAAACCG-3’；

下游引物（HrcCR）:5’-GCGGTAGGTAATCAAGGCCAC-3’；

擴(kuò)增產(chǎn)物為476bp。

E.3反應(yīng)體系

見表E.1.

反應(yīng)組成體積，μL

10×PCRbuffer5

25mmMgCl23

25mmdNTP2

引物（20μm）1

5U/μLTaqDNA聚合酶0.5

模板DNA2

ddH2O34

總體積50

E.4反應(yīng)條件

94℃變性3min；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延

伸5min。

如采用市售的試劑盒，按照說(shuō)明作適當(dāng)調(diào)整。

E.5電泳分析

取5μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL的6×上樣緩沖液混合均勻，上樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，80V電泳1h，

溴化乙錠（EB）染色20min～30min后，凝膠成像系統(tǒng)中觀察，記錄觀察結(jié)果。

11

FF

附錄F

（規(guī)范性附錄）

植物有害生物樣本檢測(cè)報(bào)告

植物名稱品種名稱

植物生育期樣品數(shù)量取樣部位

樣品來(lái)源送檢日期送檢人

送檢單位聯(lián)系電話

檢測(cè)方法：

檢測(cè)結(jié)果：

備注：

檢測(cè)人（簽名）：

審核人（簽名）：

檢測(cè)單位蓋章：

年月日

注：本單一式三份，檢測(cè)單位、受檢單位和檢疫機(jī)構(gòu)各一份。

12

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉鳳權(quán)、徐會(huì)永、趙楊揚(yáng)、趙延存、孫偉波。

I

梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了梨枯梢病監(jiān)測(cè)與檢測(cè)的原理、試劑與材料、儀器與用具、監(jiān)測(cè)技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、結(jié)果

判定和報(bào)告、樣品、菌種保藏和無(wú)害化處理、疫情處置等要求。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于梨枯梢病田間監(jiān)測(cè)以及苗木、砧木、接穗和果實(shí)上傳帶的梨枯梢病菌的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

NY/T2292亞洲梨火疫病監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

SN/T1157進(jìn)出境植物苗木檢疫規(guī)程

SN/T1193基因分析檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3原理

梨枯梢病，病原為亞洲梨火疫病菌（ErwiniapyrifoliaeKimetal.），是為害梨樹的重要細(xì)菌病害之

一，屬我國(guó)規(guī)定的檢疫性有害生物?？梢愿鶕?jù)田間癥狀、菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征、致病性、免疫學(xué)反應(yīng)和

分子生物學(xué)特征等進(jìn)行監(jiān)測(cè)與檢測(cè)。

4試劑與材料

檢測(cè)中所需的所有試劑與培養(yǎng)基，參見附錄A。

除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。

5儀器與用具

超凈工作臺(tái)、電子天平、磁力攪拌器、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱、水浴鍋、顯微鏡、高速臺(tái)式離心機(jī)、

電泳儀、常規(guī)PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、冰箱、超低溫冰箱、超純水器、恒溫干燥箱、恒溫?fù)u床、微量移

液器、制冰機(jī)等。

6監(jiān)測(cè)技術(shù)

6.1監(jiān)測(cè)植物

梨，主要監(jiān)測(cè)亞洲梨。

1

6.2監(jiān)測(cè)區(qū)域

重點(diǎn)監(jiān)測(cè)亞洲梨集中種植區(qū)、引種繁育基地、苗木集散地等疫情發(fā)生高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)。

6.3監(jiān)測(cè)方法

6.3.1苗木監(jiān)測(cè)

對(duì)從疫情發(fā)生區(qū)調(diào)運(yùn)的苗木或疫區(qū)市場(chǎng)銷售的苗木，按照SN/T1157要求進(jìn)行抽樣，并對(duì)樣品進(jìn)行

室內(nèi)檢測(cè)。

6.3.2田間監(jiān)測(cè)

從梨樹開花期開始，對(duì)當(dāng)?shù)剞r(nóng)技員、果農(nóng)等相關(guān)人員進(jìn)行訪問(wèn)調(diào)查，并選擇有代表性的梨園進(jìn)行踏

查。重點(diǎn)觀察田間有無(wú)梨枯梢病典型癥狀（見附錄B），如發(fā)現(xiàn)可疑病株立刻進(jìn)行標(biāo)記、拍照并取樣，

樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)鑒定。對(duì)梨園中梨枯梢疑似癥狀及其發(fā)生地點(diǎn)、發(fā)生時(shí)間、危害情況等信

息進(jìn)行記錄（見附錄C）。

在疫情發(fā)生區(qū)，選擇有代表性的梨園進(jìn)行定點(diǎn)監(jiān)測(cè)。從梨樹開花期開始，每隔7d調(diào)查一次。采用5

點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)隨機(jī)調(diào)查5株，統(tǒng)計(jì)或計(jì)算病株率和病梢率，并做好相關(guān)記錄。監(jiān)測(cè)過(guò)程中病梢的選取

按照NY/T2292中的規(guī)定執(zhí)行。

7檢測(cè)技術(shù)

7.1樣品處理

選擇表現(xiàn)典型癥狀并帶有菌膿的植物部位如花朵、嫩梢、幼枝、葉片或幼果等，在無(wú)菌條件下切取

病健交界處組織約（3mm～5mm）×（3mm～5mm），表面消毒和清洗后，在裝有適量無(wú)菌水的離心

管中輕輕擠壓，浸泡10min～30min后制成樣品懸浮液?；蛘咧苯犹羧【摬⒂脽o(wú)菌水清洗后制成樣品

懸浮液。懸浮液可用于其后的形態(tài)觀察、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)等。

7.2檢測(cè)方法

7.2.1顯微鏡檢查

對(duì)于疑似癥狀的植物組織，切取病健交界處20mm2，平放在載玻片的水滴中，加蓋玻片后，在低

倍顯微鏡下觀察有無(wú)噴菌現(xiàn)象。

7.2.2培養(yǎng)特征檢測(cè)

將樣品懸浮液在YPDA培養(yǎng)基平板上劃線或稀釋分離，28℃倒置培養(yǎng)24h～72h。在YPDA培養(yǎng)基平

板上觀察分離得到的細(xì)菌單菌落的形狀、大小、顏色、光澤、隆起的形狀、粘稠度、透明度、邊緣特征

以及質(zhì)地、水溶性色素等特征，觀察并進(jìn)行記錄（參見附錄B）。

7.2.3形態(tài)特征檢測(cè)

按照常規(guī)染色方法，在顯微鏡下觀察細(xì)菌菌體的形狀、大小及排列情況、有無(wú)鞭毛及鞭毛著生的位

置和數(shù)目、是否產(chǎn)生莢膜和芽胞、芽胞著生的部位和形狀、細(xì)胞內(nèi)含物等特征。

7.2.4致病性測(cè)定

2

取梨幼果（直徑大約3cm～5cm）洗凈晾干，用滅菌刀片橫切果實(shí)，置于墊有濕潤(rùn)的滅菌濾紙的培

養(yǎng)皿中。用無(wú)菌接種針蘸取培養(yǎng)24h～36h的菌落，針刺接種于幼果果肉組織，一個(gè)橫切面接種3個(gè)～4

個(gè)點(diǎn)。接種后26℃保濕培養(yǎng)，24h后觀察并記錄接種部位有無(wú)壞死癥狀發(fā)生和菌膿形成。以無(wú)菌水為對(duì)

照。

7.2.5ELISA檢測(cè)

挑取少量分離到的病原菌配制成108CFU/mL懸浮液進(jìn)行ELISA檢測(cè)，檢測(cè)程序參見附錄D。如采用

商品化ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

7.2.6PCR檢測(cè)

挑取少量分離到的病原菌配制成108CFU/mL懸浮液，1mL菌懸液提取DNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)

程序見附錄E。如采用市售的試劑盒，按說(shuō)明操作。檢測(cè)過(guò)程中防污染措施按照SN/T1193中的規(guī)定執(zhí)行。

8結(jié)果判定和報(bào)告

8.1結(jié)果判定

8.1.1癥狀識(shí)別判定

田間梨樹發(fā)病癥狀符合附錄B描述的梨枯梢病典型癥狀，判斷為梨枯梢病。

8.1.2常規(guī)檢測(cè)結(jié)果判定

鏡檢有菌溢現(xiàn)象；分離物形態(tài)特征和培養(yǎng)特性與梨枯梢病菌相符（參見附錄B）；致病性測(cè)定可在

接種部位產(chǎn)生高度隆起的乳白色菌膿，最后組織變褐壞死，但不發(fā)臭；能再次從接種發(fā)病部位分離到目

標(biāo)病原菌，確定病原菌為梨枯梢病菌。

8.1.3ELISA檢測(cè)結(jié)果判定

在陰性對(duì)照OD值≤0.1，且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性

對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶有梨枯梢病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品不帶梨枯梢

病菌。

8.1.4PCR檢測(cè)結(jié)果判定

觀察電泳結(jié)果，陽(yáng)性對(duì)照在476bp處有條帶出現(xiàn)，且陰性對(duì)照無(wú)條帶，待測(cè)樣品在476bp處有條帶

出現(xiàn)，判斷樣品中含有梨枯梢病菌；否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品中不帶梨枯梢病菌。

8.2結(jié)果報(bào)告

8.2.1監(jiān)測(cè)報(bào)告

記錄監(jiān)測(cè)結(jié)果