3.2+基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第3章

基因工程蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡要過程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定第二節(jié)基因工程的基本操作程序

一、目的基因的篩選與獲?。?）種類：編碼蛋白質(zhì)的基因（主），具有調(diào)控作用的因子（次）1.目的基因（1）概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因注意：

所有的基因都編碼蛋白質(zhì)或肽鏈。不是基因的種類一般分為結(jié)構(gòu)基因、轉(zhuǎn)錄基因和調(diào)控基因。結(jié)構(gòu)基因的功能：具有轉(zhuǎn)錄和翻譯功能，能控制生物性狀（編碼蛋白質(zhì)或肽鏈）。轉(zhuǎn)錄基因的功能：只有轉(zhuǎn)錄功能，沒有翻譯功能，能轉(zhuǎn)錄形成tRNA和rRNA。調(diào)控基因的功能：不能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，只能調(diào)控其他基因的表達(dá)。編碼區(qū)：非編碼區(qū)：原核基因真核基因編碼區(qū)非編碼區(qū)：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列不編碼蛋白質(zhì)，含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列

(如啟動(dòng)子、終止子等）外顯子：內(nèi)含子：在細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄出mRNA后，在翻譯前被剪切掉能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的mRNA，進(jìn)一步能編碼出蛋白質(zhì)的DNA序列不編碼蛋白質(zhì)，含有能調(diào)控遺傳信息表達(dá)的DNA序列(如啟動(dòng)子、終止子等）原核生物真核生物編碼區(qū)（轉(zhuǎn)錄區(qū)）非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動(dòng)子啟動(dòng)子終止子終止子外顯子內(nèi)含子（3）基因的結(jié)構(gòu)不能編碼蛋白質(zhì)的序列=

非編碼區(qū)原核生物的基因：不能編碼蛋白質(zhì)的序列真核生物的基因：=非編碼區(qū)+內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點(diǎn)編碼區(qū)是

的編碼區(qū)是間隔的、

的相同點(diǎn)都由能夠編碼蛋白質(zhì)的

和具有調(diào)控作用的

區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼【總結(jié)】原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較（2）實(shí)例：Bt抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程用蘇云金桿菌制成的生物殺蟲劑廣泛用于防治棉花蟲害對(duì)Bt基因的表達(dá)產(chǎn)物Bt抗蟲蛋白有了較為深入的了解蘇云金桿菌的殺蟲作用與Bt基因有關(guān)掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因（1）較為有效的方法：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。功能清晰已知結(jié)構(gòu)2.篩選合適的目的基因（3）認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法測(cè)序技術(shù)→序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）→序列對(duì)比工具（如BLAST）Q1：Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理是什么？當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Q2：為什么Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。Q3：明確了目的基因后，該怎么獲得它呢？3.獲取目的基因的方法（1）人工合成目的基因：（目的基因較小且全部序列已知）（2）從基因文庫中獲取基因組文庫部分基因文庫（如cDNA文庫）（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因DNA合成儀方法一：人工合成目的基因①前提：②方法：目的基因比較小、核苷酸全部序列已知DNA合成儀→直接合成目的基因Q3：化學(xué)合成法

（能/不能）合成自然界不存在的新基因，使生物產(chǎn)生新的性狀以滿足人類的要求。不含；參與翻譯的mRNA序列是由編碼序列轉(zhuǎn)錄而來。Q1：化學(xué)法合成的目的基因

（含/不含）內(nèi)含子、啟動(dòng)子和終止子？多種；遺傳密碼具有簡并性或一種氨基酸可能由多個(gè)密碼子決定。Q2：若是控制同一種蛋白質(zhì)合成的目的基因，利用化學(xué)合成法合成的基因可能有

（一種/多種），理由是？能（主要指cDNA文庫）基因文庫基因組文庫部分基因文庫方法二：從基因文庫中獲取目的基因基因文庫：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因。基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。部分基因文庫：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體，如cDNA文庫。提取某種生物的全部DNA基因組所有基因?qū)⒚總€(gè)基因與載體連接，導(dǎo)入不同受體菌中儲(chǔ)存用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈罨蚪M文庫構(gòu)建①基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫中的基因含啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子！某種生物（某一發(fā)育時(shí)期）的（成熟的）單鏈mRNA與mRNA互補(bǔ)的單鏈DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入不同受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶構(gòu)建②部分基因文庫（如cNDA文庫）的構(gòu)建注意：cDNA文庫中的基因不含啟動(dòng)子、終止子和內(nèi)含子。PCR擴(kuò)增儀PCR技術(shù)由穆里斯等人于1985年發(fā)明，于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。方法三：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因①PCR技術(shù)的概況PCR是_______________的縮寫，是一項(xiàng)根據(jù)___________________的原理，在____提供參與DNA復(fù)制的_______與_________，對(duì)____________________進(jìn)行________的技術(shù)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制全稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因留復(fù)制原理操作環(huán)境目的優(yōu)點(diǎn)：利用PCR：①擴(kuò)增已得到的基因；

②獲取并擴(kuò)增DNA分子中的目的基因。重溫：DNA體內(nèi)復(fù)制的過程解旋酶（氫鍵斷裂）DNA聚合酶（形成磷酸二酯鍵）氫鍵的形成是自發(fā)的，不需要能量和酶（1）模板：親代DNA的兩條鏈

（2）原料：4種游離的脫氧核苷酸（3）能量：ATP（4）酶：

DNA體內(nèi)復(fù)制的條件②PCR技術(shù)所需的基本條件通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增儀參與的組分在DNA復(fù)制中的作用模板：2條DNA母鏈提供DNA復(fù)制的模板原料：dNTP(4種脫氧核苷酸)合成DNA子鏈的原料能量：dNTP為合成DNA子鏈供能解旋酶：體外用高溫代替打開DNA雙鏈DNA聚合酶：耐高溫（Tap酶）催化合成DNA子鏈引物：2種小分子DNA片段使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸一定的緩沖液（Mg2＋）Mg2＋激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶dNTP的作用：既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。4種脫氧核苷酸(實(shí)質(zhì)是4種脫氧核苷三磷酸dNTP)1）原料：③PCR的條件解讀：dATPdGTPdCTPdTTP歷史不能忘記中國科學(xué)家對(duì)PCR的貢獻(xiàn)（P86）2）耐高溫的DNA聚合酶③PCR的條件解讀：Ⅰ.引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。

長度通常為20~30個(gè)核苷酸。

若引物長度過短，則：引物與模板鏈結(jié)合的特異性較差。

細(xì)胞中：一段單鏈RNAPCR中：一段人工合成的單鏈DNAⅡ.DNA聚合酶不具有從頭合成子鏈的功能，引物為DNA聚合酶提供了游離的3′端，

使DNA聚合酶從3′端延伸子鏈。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2Ⅲ.由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模蛄胁煌?，所以需?種引物。2）引物③PCR的條件解讀：PCR的過程

目的基因DNA__________后__________，______與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合；然后以___________為模板在____________作用下進(jìn)行_____，即將4種____________加到____________，如此重復(fù)循環(huán)多次。受熱變性解為單鏈引物延伸單鏈DNADNA聚合酶引物的3’端脫氧核苷酸

由于延伸后得到的_____又可以作為下一個(gè)循環(huán)的_____，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加_____，即成_____形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。產(chǎn)物模板一倍指數(shù)每次循環(huán)一般可以分為_____、_____、_____三步。變性復(fù)性延伸③PCR反應(yīng)過程歸納第1步：變性當(dāng)溫度>90℃時(shí)，雙鏈DNA解旋為單鏈。斷氫鍵5’3’3’5’5’3’3’5’1)變性2)復(fù)性3)延伸冷卻加熱預(yù)變性90℃以上增加大分子模板DNA徹底變性的概率③PCR擴(kuò)增目的基因的過程：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。5’3’3’5’第2步：復(fù)性5’3’3’5’1)變性2)復(fù)性3)延伸冷卻加熱③PCR擴(kuò)增目的基因的過程：③PCR擴(kuò)增目的基因的過程：當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，加到引物的3’端，合成新的DNA鏈。DNA新鏈延伸的方向：

5’端→3’端5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第3步：延伸1)變性2)復(fù)性3)延伸冷卻加熱④結(jié)果：

指數(shù)形式擴(kuò)增加的原因：一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。⑤PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定：瓊脂糖凝膠電泳以指數(shù)方式擴(kuò)增，產(chǎn)生2n個(gè)DNA片段100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp1,200bp1,000bp900bp標(biāo)準(zhǔn)樣品1樣品2樣品3

較小的DNA片段在凝膠中移動(dòng)相對(duì)容易，較大的DNA片段移動(dòng)難。當(dāng)電泳結(jié)束時(shí)，比較DNA樣品所在的位置和一系列已知大小的DNA片段的位置（標(biāo)準(zhǔn)），這些已知大小的片段稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)樣。單鏈RNADNA-RNA雜交分子單鏈DNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶核酸酶H降解RNA鏈DNA聚合酶

mRNA不可以直接擴(kuò)增，需逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增，稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，簡稱RT-PCR。Q：利用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’目的基因目的基因Q：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，在第幾次循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段（即出現(xiàn)完整的目的基因）？第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’非目的基因序列目的基因序列引物第一輪循環(huán)基因數(shù)=2=21引物數(shù)=2=22-2基因數(shù)=4=22引物數(shù)=6=23-2第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)基因數(shù)=8=23引物數(shù)=14=24-2n次循環(huán)后，目的基因數(shù)為2n，需要引物數(shù)為2n+1-2。⑥PCR相關(guān)計(jì)算第一輪循環(huán)第二輪循環(huán)第三輪循環(huán)3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’⑥PCR相關(guān)計(jì)算第一輪第二輪第三輪第N輪DNA分子數(shù)含引物A或引物B的DNA分子數(shù)同時(shí)含引物A和引物B的DNA分子數(shù)共消耗引物數(shù)2n－17130262n－226142n+1－22122232n⑥PCR相關(guān)計(jì)算第一輪第二輪第三輪第N輪長鏈－中鏈組合的DNA分子數(shù)中鏈－短鏈組合的DNA分子數(shù)短鏈－短鏈組合的DNA分子數(shù)20022202422n-22n-2n長鏈條數(shù)：始終是最初DNA分子的兩條鏈。中鏈條數(shù)：始終是最初DNA分子的兩條長鏈為模板形成的，并且每復(fù)制一次，新形成的中鏈增加兩條。短鏈條數(shù)：所有的DNA分子中，除長鏈和中鏈外，余下的即為短鏈。5’3’3’5’Q1：引物是什么？引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物通常為20~30個(gè)核苷酸。若引物長度過短，則：引物與模板鏈結(jié)合的特異性較差。細(xì)胞中：一段單鏈RNA，PCR中：一段人工合成的單鏈DNA。⑦關(guān)于引物的若干問題Q2：為什么需要引物？DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。Q3：引物的作用？使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。Q4:設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是？Q5:為什么延伸時(shí)需要加入兩種引物？目的基因兩端的核苷酸序列。DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物的3'端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。Q6:兩種引物與模板鏈的哪一端配對(duì)？3’5’3’5’引物的5′端與模板鏈的3′端互補(bǔ)配對(duì)Q7:引物設(shè)計(jì)的要求（或引物失效的原因）？引物設(shè)計(jì)的要求：a.引物自身不能環(huán)化。b.兩種引物之間不能發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)。c.引物長度不宜過短，防止引物隨機(jī)結(jié)合。d.引物太短則特異性不夠強(qiáng)；太長則退火溫度會(huì)比較高。第1組：