劉小龍 循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測策略及臨床意義

循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)檢測策略及臨床意義劉小龍，博士、研究員福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院，中國科學(xué)院海西研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心腫瘤診療的困境：早期診斷困難，錯過最正確治療時機(jī)；易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差；放化療易產(chǎn)生耐受；缺乏有效的治療靶點等。早診早治，實時監(jiān)控、靶向用藥及個體化診療是提高腫瘤遠(yuǎn)期生存率、降低死亡率的關(guān)鍵。腫瘤診斷方法循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征〔包括突變，缺少，插入，重排，拷貝數(shù)異常，甲基化等〕來自腫瘤基因組的DNA片段；來源：1、來自于壞死的腫瘤細(xì)胞；2、來自于凋亡的腫瘤細(xì)胞；3、循環(huán)腫瘤細(xì)胞；4、來自于腫瘤細(xì)胞分泌的外排體；含量低，約占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%。ctDNA開展簡史1948年首次發(fā)現(xiàn)人體血液中存在著循環(huán)DNA，癌癥患者的循環(huán)腫瘤DNA那么發(fā)現(xiàn)于1977年。1994年發(fā)現(xiàn)這些DNA含有癌癥的標(biāo)志性突變，證明其來自于腫瘤。鑒于腫瘤DNA會流入血液，香港中文大學(xué)的盧煜明〔DennisLo〕教授推測胎兒DNA應(yīng)該也能進(jìn)入血液。1997年證明孕婦血液中攜帶著男性胎兒的Y染色體。該發(fā)現(xiàn)允許醫(yī)生們在懷孕初期通過無創(chuàng)方式檢測胎兒的性別，甚至篩查唐氏綜合癥等發(fā)育疾病。這是產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的一次革命。ctDNA優(yōu)勢無創(chuàng)、無損、實時、屢次；當(dāng)不能獲得腫瘤組織信息時，可以開展“液體活檢〞；假陽性率低，靈敏度高，準(zhǔn)確度高，可用于腫瘤的早期診斷；能夠?qū)δ[瘤的演化和適應(yīng)性改變進(jìn)行監(jiān)控；能夠?qū)δ[瘤病人的治療效果進(jìn)行實時監(jiān)控〔尤其在追蹤腫瘤轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面〕，并進(jìn)行個性化的治療方案指導(dǎo)〔如個性化靶向藥物用藥，個性化化療等〕。

一類具備廣泛應(yīng)用前景的腫瘤標(biāo)志物，可無創(chuàng)的用于腫瘤早期診斷、開展過程監(jiān)測、預(yù)后判斷、以及個性化用藥指導(dǎo)。敏感度已知突變位點檢測（突變率<2%）數(shù)字PCRBEAMing技術(shù)標(biāo)記擴(kuò)增深度測序（TAM-Seq）癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)未知突變位點檢測（突變率>2%）全基因組測序全外顯子測序RNA末端平行分析法全基因組甲基化測序數(shù)字PCR將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反響分配到大量微小的反響器中，在每個反響器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板)，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增〞，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反響器的數(shù)目“數(shù)出〞目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。陰性微滴比例推算起始靶分子的絕對量泊松分布一個待分析的PCR反應(yīng)體系成千上萬個獨立的PCR反應(yīng)體系:靶標(biāo)分子:有限稀釋●:陽性微滴（1）○:陰性微滴（0）泊松分布PCR擴(kuò)增優(yōu)點：可絕對定量，靈敏度可達(dá)單個核酸分子，檢測限低至0.001%；缺點：只能檢測的突變位點，通量低；利用數(shù)字PCR監(jiān)測肺癌病人中第一次服用埃羅替尼抗腫瘤藥物后的血漿EGFR突變情況。經(jīng)過治療后，所有病人的EGFR突變都出現(xiàn)下降，其中有8個病人突變完全消失。有6個病人的EGFR突變在后續(xù)出現(xiàn)上升，提前揭示疾病進(jìn)展。另外3個病人的EGFR突變沒有變化，病情無明顯進(jìn)展。數(shù)字PCR可以用于評估和監(jiān)測血漿中ctDNA的特異突變ctDNA:P=0.006CEA:P=0.03ComparisonofctDNA,CEAandimagingdynamicsinindividualstudysubjects標(biāo)記擴(kuò)增深度測序〔TAM-Seq〕二步擴(kuò)增：預(yù)擴(kuò)增：利用特異性引物進(jìn)行15偱環(huán)的目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增標(biāo)簽擴(kuò)增：利用通用不同特性的接頭標(biāo)簽進(jìn)行二次擴(kuò)增雙向重復(fù)測序：提高測序精度突變頻率檢出率可達(dá)2%敏感性和特異性高于97%本錢較低，利于臨床應(yīng)用設(shè)計了48對引物去擴(kuò)增TP53，EGFR，BARF，KRAS等癌癥相關(guān)基因的5995bp突變區(qū)域同時可對10個特異的癌癥突變位點進(jìn)行監(jiān)控用于確定多發(fā)癌癥患者的復(fù)發(fā)病灶用于監(jiān)控癌癥患者的腫瘤動態(tài)開展癌癥個體化深度測序(CAPP-Seq)該方法利用定制化的突變位點庫作為〞篩選器〞，對樣本進(jìn)行靶向捕獲后再進(jìn)行超深度測序〔可到達(dá)10000X〕，其對腫瘤的ctDNA檢測靈敏度更高，特異性更強，與全外顯子測序等相比經(jīng)濟(jì)可行。StageI檢出率50%StageII-IV檢出率100%特異性可到達(dá)96%突變檢出率0.02%Selector區(qū)域：139個基因的521個外顯子和13個內(nèi)含子，約125K，占人基因組的0.004%測序覆蓋深度10000X腫瘤的早期診斷動態(tài)監(jiān)測腫瘤的發(fā)生開展及療效評估腫瘤的異質(zhì)性評估腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險靶向檢測耐藥突變，跟蹤獲得性耐藥的開展，進(jìn)行個性化用藥指導(dǎo)ctDNA的臨床應(yīng)用ctDNActDNA的分析指標(biāo)4cfDNA含量1235ctDNA突變頻率微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性ctDNA甲基化頻率ctDNA的分析指標(biāo)4cfDNA含量1235ctDNA突變頻率微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性ctDNA甲基化頻率乳腺癌病人〔尤其在轉(zhuǎn)移性乳腺癌〕的血漿cfDNA的完整性顯著下調(diào)，而血漿cfDNA的濃度顯著上調(diào)，可作為早期診斷的標(biāo)志物，具有較好的敏感度和特異性。肝癌病人的血漿中存在兩種不同長度的DNA分子：短鏈DNA分子〔<150bp〕和長鏈DNA分子〔>180bp〕；短鏈DNA分子與ctDNA突變率及拷貝數(shù)異常相關(guān)，且與ctDNA濃度正相關(guān)；長鏈DNA分子不攜帶腫瘤相關(guān)ctDNA特征，且與ctDNA濃度負(fù)相關(guān)。肝癌病人血漿中線粒體DNA的含量顯著高于健康人、乙肝及肝硬化患者，對肝癌的診斷具有較高的靈敏性和特異性，分別達(dá)80%和94%，可作為肝癌診斷的有效分子標(biāo)記。ProcNatlAcadSciUSA.

2021Mar17;112(11):E1317-25.doi:10.1073/pnas.1500076112.Epub2021Feb2.Lengthening

and

shortening

of

plasma

DNA

in

hepatocellular

carcinoma

patients.線粒體DNA可用于肝癌的診斷JClinPathol

2021;66:775-778

AmericanJournalofClinicalPathology

2021;143(1):18-24.

PLoSOne.2021;10(4):e0108247.ctDNA的分析指標(biāo)4cfDNA含量1235ctDNA突變頻率微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性ctDNA甲基化頻率

利用數(shù)字PCR檢測640例不同癌癥病人的血漿ctDNA，在超過75%的病人血液中檢測到ctDNA，原發(fā)癌檢出率約為50%。在結(jié)腸癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA檢出率分別為73%,57%,48%,50%。

相對于原發(fā)癌，ctDNA在轉(zhuǎn)移癌中檢出率更高，且分期越高，ctDNA檢出率也更高；可用于耐藥突變的檢測；ctDNA是普遍適用的、敏感和特異的標(biāo)志物,可用于不同類型癌癥患者的臨床監(jiān)測。NEnglJMed2021;368:1199-1209在30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者接受系統(tǒng)性治療的不同時間點測定血液中的ctDNA，CA15-3，CTC細(xì)胞的含量，比較三者之間的敏感度。ComparisonofCirculatingTumorDNA,CA15-3,andCirculatingTumorCellsasBlood-BasedBiomarkers

靈敏度：偱環(huán)腫瘤DNA：85%CA15-3：59%

靈敏度：偱環(huán)腫瘤DNA：90%偱環(huán)腫瘤細(xì)胞：67%ComparisonofCirculatingBiomarkerstoMonitorTumorDynamicsandPredictSurvival.結(jié)論：相對于蛋白類診斷標(biāo)志物CA15-3及血液中的偱環(huán)腫瘤細(xì)胞，ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)開展中具有更高的靈敏度。血漿中ctDNA的含量與預(yù)后密切相關(guān)，含量越高，病人的5年生存率越低〔P<0.001〕。ctDNA含量的增高及CTC數(shù)目的增加，病人的預(yù)后顯著變差，而CA15-3沒有預(yù)后判斷功能。監(jiān)測ctDNA的突變率比監(jiān)測cfDNA濃度，對胃癌動態(tài)開展的監(jiān)控靈敏度更高。ctDNA在監(jiān)測腫瘤的動態(tài)開展中具有更高的靈敏度和特異性；ctDNA能比蛋白類標(biāo)志物CA15.3更早的預(yù)測腫瘤動態(tài)開展情況。相對于傳統(tǒng)的影像學(xué)及蛋白類血清標(biāo)志物，通過評估ctDNA的突變頻率能更早、更準(zhǔn)確的預(yù)測結(jié)腸癌患者腫瘤經(jīng)治療后的動態(tài)開展情況。ctDNA的分析指標(biāo)4cfDNA含量1235ctDNA突變頻率微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性ctDNA甲基化頻率利用亞硫酸氫鹽平行測序檢測不同腫瘤患者〔肝癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌等〕血漿DNA甲基化發(fā)生情況及血漿DNA拷貝數(shù)異常情況，用于腫瘤的診斷及腫瘤負(fù)荷的監(jiān)測；血漿中甲基化癌癥診斷靈敏度為74%，特異性為94%，具有較好的癌癥診斷應(yīng)用價值。PercentageofbinsshowinghypomethylationinHCCpatientsandchronichepatitisBvirus(HBV)carrierswithcirrhosis血漿DNA的甲基化程度在肝癌患者顯著上升，可用于肝癌的診斷；靈敏度為81%，特異性為94%；血漿DNA拷貝數(shù)異常用于肝癌診斷，靈敏度為81%，特異性為88%。ClinCancerRes

July1,2004

10;

4420JournalofThoracicOncology:20216:1632-1638WorldJGastroenterol.2021Nov28;17(44):4917–4921.Int.J.Cancer:131,1153–1157(2021)ONCOLOGYREPORTS32:505-512,2021ctDNA的分析指標(biāo)4cfDNA含量1235ctDNA突變頻率微衛(wèi)星雜合性cfDNA完整性ctDNA甲基化頻率血漿中短鏈DNA分子發(fā)生雜合性喪失的頻率顯著高于長鏈DNA分子。血漿中短鏈DNA的cyclinD2基因〔D12S