食品生物技術(shù)導(dǎo)論酶工程

食品生物技術(shù)導(dǎo)論酶工程第一節(jié)酶工程發(fā)展概況1.酶的化學(xué)本質(zhì)是指一類由活性細(xì)胞產(chǎn)生的、具有催化活性作用和高度專一性的特殊蛋白質(zhì)，又稱生物催化劑。第2頁,共92頁，2024年2月25日，星期天不自覺的應(yīng)用：傳統(tǒng)的釀酒、制醬、制曲等。初步認(rèn)識(shí)酶的存在及作用：1833年，佩恩和帕索茲發(fā)現(xiàn)能水解淀粉的酒精沉淀物（淀粉酶）并提出其熱不穩(wěn)定性；1896年，巴斯德發(fā)現(xiàn)酒精發(fā)酵是由酵母引起的；1897年，巴納兄弟用酵母抽提液生產(chǎn)出了酒精；2.酶工程發(fā)展簡史第3頁,共92頁，2024年2月25日，星期天對酶的催化理論及本質(zhì)的研究：1913年，米徹里斯和曼吞由中間產(chǎn)物學(xué)說推導(dǎo)出米氏方程；1926年，薩母納從刀豆中提出脲酶，并通過大量研究證實(shí)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)。20世紀(jì)60年代，固定化技術(shù)的發(fā)展標(biāo)志著酶工程產(chǎn)業(yè)化形成；20世紀(jì)80年代，酶分子修飾技術(shù)發(fā)展使酶工程得到空前發(fā)展。第4頁,共92頁，2024年2月25日，星期天3.酶工程的概念酶工程（enzymeengineering）又稱酶技術(shù)，指利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需要的產(chǎn)品的過程，是酶學(xué)理論與化學(xué)工程相結(jié)合而形成的一門科學(xué)技術(shù)。第5頁,共92頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)酶的制備與發(fā)酵生產(chǎn)主要途徑從生物細(xì)胞內(nèi)合成或直接提取分離；從微生物發(fā)酵生產(chǎn)獲取。第6頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（一）從生物細(xì)胞獲取1.植物細(xì)胞產(chǎn)酶P76-78：表4-12.動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)酶P78-79第7頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（二）微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1.常用產(chǎn)酶微生物細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌等（P80表4-3）。用于食品酶制劑的細(xì)胞應(yīng)具備條件：安全可靠，非致病菌；穩(wěn)定性好不易感染噬菌體；酶產(chǎn)量高，有較好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值；容易培養(yǎng)和管理，產(chǎn)酶細(xì)胞易生長繁殖；能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短。第8頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2.發(fā)酵方法（1）固體發(fā)酵法

即以麩皮、米糠等為基本原料，加無機(jī)鹽和適量水分(通常50％左右)進(jìn)行的一種微生物培養(yǎng)法。用青霉、曲霉生產(chǎn)果膠酶；用木霉生產(chǎn)纖維素酶（2）液體發(fā)酵法

利用合成的液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)，是目前主要的方式。第9頁,共92頁，2024年2月25日，星期天①

間歇發(fā)酵法：特點(diǎn)：先在適于菌體生長條件下培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入產(chǎn)酶條件下進(jìn)行發(fā)酵。產(chǎn)酶量高，同時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)與誘導(dǎo)物浪費(fèi)少。②連續(xù)發(fā)酵法：特點(diǎn)：先將菌體培養(yǎng)至某一生長期如對數(shù)期，然后一邊連續(xù)加入新鮮培養(yǎng)液，另外又不斷地以相同速度放出培養(yǎng)產(chǎn)物，二者的速度應(yīng)和生長速度一致，使菌體生長處于恒態(tài)條件，同時(shí)還可能打破酶合成的反饋?zhàn)瓒?，使產(chǎn)酶率提高。第10頁,共92頁，2024年2月25日，星期天3.微生物發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件及控制（1）培養(yǎng)基：碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子（2）溫度：（3）pH：（4）溶氧量：（5）發(fā)酵時(shí)間：第11頁,共92頁，2024年2月25日，星期天選育優(yōu)良細(xì)胞（基因重組技術(shù)）強(qiáng)化生產(chǎn)過程：

控制合理發(fā)酵條件：pH、溫度、基質(zhì)濃度等添加誘導(dǎo)物：如乳糖誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶控制阻遏物濃度：產(chǎn)物積累一定濃度，合成受阻添加表面活性劑：主要是非離子型表面活性劑添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑：植酸鈣鎂、聚乙烯等4.提高微生物產(chǎn)酶量的措施第12頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（三）酶的分離純化1.細(xì)胞分離（胞外酶）:

離心或過濾2.細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）：許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)，提取這些胞內(nèi)酶時(shí)首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破碎處理。機(jī)械破碎物理破碎化學(xué)破碎酶解破碎第13頁,共92頁，2024年2月25日，星期天機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法

物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法

化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理第14頁,共92頁，2024年2月25日，星期天提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶3.提取第15頁,共92頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)酶的分子修飾酶分子修飾（molecularmodificationenzyme）：通過改變酶分子的結(jié)構(gòu)，使酶的某些特性和功能發(fā)生改變的技術(shù)?；瘜W(xué)修飾物理修飾第16頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（一）酶分子的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾（chemicalmodification）：利用化學(xué)手段將某些化學(xué)物質(zhì)或基團(tuán)結(jié)合到酶分子上，或?qū)⒚阜肿拥哪承┎糠謩h除或置換，改變酶的理化性質(zhì)，最終達(dá)到改變酶催化性質(zhì)的目的。第17頁,共92頁，2024年2月25日，星期天1.大分子結(jié)合修飾常用大分子修飾劑：右旋糖苷、聚乙二醇、聚蔗糖β-環(huán)糊精、瓊脂糖、殼聚糖、白蛋白、明膠、淀粉、硬脂酸、聚丙氨酸等。作用：穩(wěn)定性提高、抗原性降低，等等如：1分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合可使其活力提高5.1倍。第18頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2.肽鏈有限水解修飾指在肽鏈的限定肽鍵位點(diǎn)水解，使酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變而改變酶特性和功能的方法。常用修飾劑為專一性較高的蛋白酶或肽酶。特點(diǎn)：既保持酶活力，又降低其抗原性。如木瓜蛋白酶水解去除其肽鏈上2/3氨基酸，仍可保持其活力。第19頁,共92頁，2024年2月25日，星期天3.側(cè)鏈基團(tuán)修飾：如將α-胰凝乳蛋白酶的氨基修飾成親水性更強(qiáng)的-COOH等，酶活提高1000倍，且更耐熱4.分子內(nèi)或分子間交聯(lián)：使用雙功能試劑交聯(lián)，更穩(wěn)定5.氨基酸置換修飾：改變活力中心的氨基酸6.金屬離子置換修飾：如將?；被崴饷傅幕盍χ行牡腪n2+置換為Co2+。第20頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（二）酶分子的物理修飾酶分子物理修飾（physicalmodificayion）：通過物理方法，不改變酶的組成單位及基團(tuán)，只使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變（副鍵變化或重排），而改變酶的某些特性和功能。高壓處理：酶活提高；最適條件改變適當(dāng)變性改變空間構(gòu)象：穩(wěn)定性適當(dāng)提高第21頁,共92頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)酶的非水相催化（自學(xué)）酶催化反應(yīng)的介質(zhì)有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的條件及其控制GoGoGoGo酶非水相催化的應(yīng)用Go第22頁,共92頁，2024年2月25日，星期天一、酶催化反應(yīng)的介質(zhì)水：酶促反應(yīng)最常用的反應(yīng)介質(zhì)。有機(jī)介質(zhì)：含有一定量水的有機(jī)溶劑氣相介質(zhì)：底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體的物質(zhì)超臨界介質(zhì)：超臨界流體離子液介質(zhì)：由有機(jī)陽離子與陰離子構(gòu)成的在室溫條件下呈液態(tài)的低熔點(diǎn)鹽類第23頁,共92頁，2024年2月25日，星期天二、有機(jī)介質(zhì)反應(yīng)體系1.反應(yīng)體系中水對酶催化反應(yīng)的影響酶都溶于水，只有在一定量的水存在的條件下，酶分子才能進(jìn)行催化反應(yīng)。所以酶在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行催化反應(yīng)時(shí)，水是不可缺少的成分之一。有機(jī)介質(zhì)中的水含量多少對酶的空間構(gòu)象、催化活性、穩(wěn)定性、催化反應(yīng)速度等都有密切關(guān)系，水還與酶催化作用的底物和反應(yīng)產(chǎn)物的溶解度有關(guān)。酶分子只有在空間構(gòu)象完整的狀態(tài)下，才具有催化功能。在無水的條件下，酶的空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。因此，酶分子需要一層水化層（必須水），以維持其完整的空間構(gòu)象。同時(shí)有機(jī)介質(zhì)中水的含量對酶催化反應(yīng)速度有顯著影響，存在最適水含量。第24頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2.反應(yīng)體系中有機(jī)溶劑對酶催化反應(yīng)的影響常用的有機(jī)溶劑有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，已酯，二氯甲烷等。在有機(jī)溶劑中，酶分子不能直接溶解，而是懸浮在溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)。根據(jù)酶分子和有機(jī)溶劑特性的不同，保持其空間結(jié)構(gòu)完整性的情況也有所差別。極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑，如甲醇，乙醇等，會(huì)奪取酶分子的結(jié)合水，影響酶分子微環(huán)境的水化層，從而降低酶的催化活性,甚至引起酶的變性失活。因避免酶在有機(jī)介質(zhì)中因脫水作用而影響其催化活性。有機(jī)溶劑的極性不同，在反應(yīng)過程中會(huì)影響底物和產(chǎn)物的分配，從而影響酶的催化反應(yīng)。第25頁,共92頁，2024年2月25日，星期天三、酶在有機(jī)介質(zhì)中的催化特性熱穩(wěn)定性改變底物特異性產(chǎn)生新的酶促反應(yīng)pH記憶鍵選擇性第26頁,共92頁，2024年2月25日，星期天有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)酶在有機(jī)介質(zhì)中由于水分子的減少，相對來說酶分子的構(gòu)象表現(xiàn)出比水溶液中更具有“剛性”特點(diǎn)。由于有機(jī)溶劑的存在,水量減少，大大降低了許多需要水參與的副反應(yīng)，如酸酐的水解、氰醇的消旋化和酰基轉(zhuǎn)移等。因此在有機(jī)介質(zhì)中酶的穩(wěn)定性得到顯著提高。在有機(jī)介質(zhì)中進(jìn)行的酶促反應(yīng)，可以省略產(chǎn)物的萃取分離過程,提高收率。第27頁,共92頁，2024年2月25日，星期天四、有機(jī)介質(zhì)中酶催化反應(yīng)及控制反應(yīng)類型：合成反應(yīng)、轉(zhuǎn)移反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)、異構(gòu)反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、裂合反應(yīng)等?？刂疲好傅姆N類和濃度、底物的種類和濃度、有機(jī)溶劑的種類、水含量、溫度、pH、離子強(qiáng)度第28頁,共92頁，2024年2月25日，星期天五、酶非水相催化的應(yīng)用

酶催化反應(yīng)應(yīng)用

脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機(jī)酸合成酯類轉(zhuǎn)酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯的選擇性聚合?；蚀嫉孽；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羥基化膽固醇氧化酶氧化膽固醇測定醇脫氫酶酯化有機(jī)硅醇的酯化第29頁,共92頁，2024年2月25日，星期天第五節(jié)酶的固定化產(chǎn)生背景：由于酶對食品的影響廣泛且成本很高，人們基于生物體內(nèi)的酶固定在細(xì)胞壁和膜的現(xiàn)象，提出酶的固定化，希望酶能重復(fù)使用，同時(shí)又能穩(wěn)定酶、改變酶的專一性、提高酶活力，從而改善酶的各種特性。第30頁,共92頁，2024年2月25日，星期天酶的固定化：是指將酶與不溶性載體結(jié)合，使游離酶、細(xì)胞或細(xì)胞器等的催化活動(dòng)完全或基本上限制在一定空間內(nèi)的過程。固定化后的酶其仍具有酶的催化活性，能連續(xù)進(jìn)行反應(yīng)，并且反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。第31頁,共92頁，2024年2月25日，星期天固定化酶的優(yōu)點(diǎn)易于將酶與底物及產(chǎn)物分離，因而產(chǎn)物相對容易提純；酶能夠重復(fù)利用，使用效率提高，成本低；大多數(shù)情況下可以提高酶的穩(wěn)定性；可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量；有利于實(shí)現(xiàn)管道化、連續(xù)化以及自動(dòng)化操作，易于與各種分離手段聯(lián)用。第32頁,共92頁，2024年2月25日，星期天固定化酶的缺點(diǎn)由于固定化酶是通過反應(yīng)而被結(jié)合在載體上，固定化過程中酶的活力難免有一定損失；而底物則要求是水溶性的，這樣才能夠接觸酶而發(fā)生反應(yīng)；不適宜于需要輔助因子的反應(yīng)。第33頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（一）酶的固定化原則必須維持酶的催化活性和專一性固定化的載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻固定化酶的載體應(yīng)具有最大的穩(wěn)定性第34頁,共92頁，2024年2月25日，星期天b.包埋法

a.吸附法c.共價(jià)偶聯(lián)法d.交聯(lián)法（二）酶的固定化方法第35頁,共92頁，2024年2月25日，星期天1.吸附法（1）物理吸附：通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用將酶固定于水不溶載體上的方法。有機(jī)載體：淀粉、谷蛋白、纖維、甲殼素等。如木瓜蛋白酶、堿性磷酸脂酶吸附后在載體表面形成單分子層，吸附蛋白能力約70mg/cm2。

第36頁,共92頁，2024年2月25日，星期天無機(jī)載體：活性炭、多孔玻璃、多孔陶瓷、氧化鋁、硅膠等；如：用多孔硅為載體吸附米曲霉和枯草桿菌的淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45℃進(jìn)行固定化。代表性酶：α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶特點(diǎn)：吸附容量較低(一般小于1mg蛋白/g吸附劑)；酶活力損失少；與載體結(jié)合力較弱，容易脫落。第37頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（2）離子吸附將酶與含有離子交換基團(tuán)的水不溶性載體以靜電作用力相結(jié)合的固定化方法（酶吸附較牢固）。常用的載體有陰離子交換劑，如二乙氨基乙基(DEAE)-纖維素、DEAE-Sephadex葡聚糖凝膠；陽離子交換劑，如羧甲基(CMC)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、Dowex-50等。代表性酶：葡萄糖異構(gòu)酶、糖化酶、β-淀粉酶第38頁,共92頁，2024年2月25日，星期天DEAE-Sephadex固定化氨基?；福簩EAE-SephadexA25充分溶脹．用0.5mol/LNa0H和水洗滌后，加入pH7.0~7.5的米曲霉3042粗酶液，充分混合(1g濕重載體加60ml酶液)后，于低溫下攪拌過夜后，吸去上清液，再用蒸餾水和0.15mol/L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4℃?zhèn)溆?。此外，DEAE-纖維素吸附的α-淀粉酶、蔗糖酶已作為商品固定化酶。第39頁,共92頁，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點(diǎn)：

操作簡單，處理?xiàng)l件溫和，可以得到較多高活性的固定化酶；可充分選擇不同電荷、不同形狀的載體，吸附過程可以同時(shí)純化酶，固定化酶在使用過程失活后可重新活化，同時(shí)載體可以回收再利用。缺點(diǎn)：

吸附法制備的固定化酶易脫落，影響產(chǎn)物純度和操作的穩(wěn)定性。第40頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2.包埋法指用一定方法將酶包埋于半透性的載體中，制成固定化酶的方法。（1）凝膠包埋法：指將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中制成的固定化酶或固定化菌體。常見凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹脂等。特點(diǎn)：條件溫和，對酶活影響小，但強(qiáng)度差第41頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（2）半透膜包埋法又稱微膠囊包埋法，指將酶分子定位于半透性的聚合體膜內(nèi)制成微膠囊型酶。常用半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜、硝化纖維、聚苯乙烯、殼聚糖等。特點(diǎn)：微膠囊大小可控制、膠囊化時(shí)間短、酶與底物接觸表面積大、多種酶可固定于同一膠囊，利于多酶固定。第42頁,共92頁，2024年2月25日，星期天

優(yōu)點(diǎn):

包埋法操作簡單，由于酶分子只被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，可以制得較高活力的固定化酶．對大多數(shù)酶、粗酶制劑甚至完整的微生物細(xì)胞都是適用的。

缺點(diǎn):

只有小分子底物和產(chǎn)物可以通過凝膠網(wǎng)絡(luò)，而對大分子底物不適宜。同時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)對物質(zhì)擴(kuò)散的阻力導(dǎo)致固定化酶動(dòng)力學(xué)行為的變化、活力降低。

第43頁,共92頁，2024年2月25日，星期天3.共價(jià)鍵結(jié)合法酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵而固定的方法。特點(diǎn)：結(jié)合牢固，不易脫落，利于連續(xù)使用；但載體活化操作復(fù)雜，且制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶結(jié)構(gòu)變化，使固定化酶活力降低或破壞，回收率低（約30%）。第44頁,共92頁，2024年2月25日，星期天與載體共價(jià)結(jié)合的酶功能基團(tuán)：氨基、羧基、酚基、巰基、羥基、咪唑基、吲哚基等最常見的：氨基、羧基、酪氨酸和組氨酸的芳環(huán)。常用的載體：天然有機(jī)載體：纖維素、瓊脂糖合成高聚物：尼龍、多聚氨基酸無機(jī)載體：多孔玻璃、金屬氧化物結(jié)合方法：重氮化法、烷基化法、芳基化法、溴化氰法、巰基-二硫鍵交換法等。第45頁,共92頁，2024年2月25日，星期天4.交聯(lián)法指使用雙功能試劑或多功能試劑與酶分子之間進(jìn)行交聯(lián)的固定化方法。交聯(lián)反應(yīng)可以發(fā)生在酶分子之間，也可以發(fā)生在酶分子內(nèi)部。酶濃度低時(shí)發(fā)生在酶分子內(nèi)部，酶濃度高時(shí)分子間交聯(lián)比例上升，形成固定化酶后往往為不溶態(tài)。特點(diǎn)：結(jié)合牢固，可長時(shí)間使用；但條件劇烈，酶活損失大，且固定化酶顆粒小，使用不方便。改進(jìn)：可與吸附法或包埋法結(jié)合使用。第46頁,共92頁，2024年2月25日，星期天常用交聯(lián)劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2,2-二磺酸等交聯(lián)方法：酶直接交聯(lián)法：酶輔助蛋白交聯(lián)法：吸附交聯(lián)法：載體交聯(lián)法：第47頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（1）直接交聯(lián)法：一定條件下，加入一定量戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。如：木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0℃長時(shí)間反應(yīng)，只得可溶性固定化酶，若在室溫下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。這種情況對不同酶可能有不同結(jié)果。第48頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（2）酶輔助蛋白交聯(lián)法：用雙功能或多功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯(lián)．從而制備固定化酶。輔助蛋白，如牛血清白蛋白、明膠、膠原、抗體等，與酶一起進(jìn)行交聯(lián)。例如：10mg脲酶與2.5ml含6％白蛋自、0.2％戊二醛的0.02mol/LpH．8磷酸緩沖液混合，冷卻到-30℃后，再升溫至4℃

，放置4h將形成的泡沫聚合物徹底洗除后，凍干，即為固定化脲酶。第49頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（3）載體交聯(lián)法：用多或雙功能試劑的一部分功能基團(tuán)與載體交聯(lián)，另一部分功能基團(tuán)與酶蛋白交聯(lián)而制備固定化酶的方法。單用戊二醛等試劑交聯(lián)制備的固定化酶活力較低，常將此法與吸附法、包埋法結(jié)合使用，可以達(dá)到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。第50頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（4）吸附交聯(lián)法：先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁等吸附劑上，再與雙功能試劑交聯(lián)。第51頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（三）固定化酶的性質(zhì)1.固定化酶的活力

與其溶液酶相比，大多數(shù)固定化酶活性下降。

固定化酶活力下降的原因主要有：

酶與不溶性載體相結(jié)合引起結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化；酶活性中心的重要氨基酸殘基與載體相結(jié)合。第52頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2.固定化酶的穩(wěn)定性大多數(shù)酶在固定化后都不同程度地提高了穩(wěn)定性．延長了有效壽命。

固定化酶穩(wěn)定性提高的主要原因：

固定化增加了酶構(gòu)象的牢固程度。抵擋住了不利因素對酶的侵襲。限制了酶分子間的相互作用。第53頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（1）熱穩(wěn)定性大多數(shù)酶固定化后與溶液酶相比，有較高的熱穩(wěn)定性如氨基酰化酶：溶液酶在75℃保溫15min，活力為0；其DEAE-Sephadex固定化酶在同樣條件下仍有80％；DEAE-纖維素固定化酶在同樣條件下還有60％活力。這種性質(zhì)對工業(yè)上的應(yīng)用是有益的。固定化酶反應(yīng)的溫度一般較溶液酶的高，如用CM-纖維素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最適溫度比溶液酶高5~15℃。第54頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（2）pH一酶活力關(guān)系反應(yīng)的最適pH和酶活力-pH曲線的變動(dòng)依據(jù)酶蛋白和載體的電荷而定。帶負(fù)電荷的載體，往往導(dǎo)致固定化酶的最適pH向堿性方向移動(dòng)；帶正電荷的載體則相反。例如：DEAE—纖維素固定化氨基?；概c其游離酶比較，低0.5個(gè)pH而偏向酸性方向。CM-纖維素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最適pH與游離酶比較，向堿性方向偏移0.5—1個(gè)pH單位。第55頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（3）對蛋白酶的抵抗力提高溶液酶經(jīng)固定化后提高了對蛋白酶的抵抗能力。比如：氨基酰化酶在胰蛋白酶作用下活力僅存20％，而將其固定于DEAE—纖維素上在同樣條件下仍有80％的活力。這可能是因?yàn)榈鞍酌阜肿恿看?，受到空間位阻，不能進(jìn)入固定化酶中。第56頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（4）對變性劑、抑制劑的抵抗能力提高酶經(jīng)固定化后，提高了對蛋白質(zhì)變性劑和抑制劑的抵抗能力。例如：氨基?；概c固定于DEAE-Sephadex的氨基酰化酶比較，前者在6mol、2mol胍、1％SDS和4mmol丙酮溶液中活力分別為9％、49％、1％和55％，而后者在相應(yīng)溶液中活力則分別為146％、117％、35％和138％。第57頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（5）操作穩(wěn)定性固定化酶在操作中可以長期使用。通常用半衰期(t1/2)來衡量，即酶活性達(dá)到原有酶活性一半時(shí)所需的時(shí)間較長。工業(yè)中半衰期通常在一個(gè)月以上才有應(yīng)用價(jià)值第58頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（6）貯藏穩(wěn)定性大多數(shù)酶經(jīng)固定化后提高了貯藏的穩(wěn)定性，如固定化木瓜蛋白酶（瓊脂）在4℃下，120d酶活力無變化。第59頁,共92頁，2024年2月25日，星期天第六節(jié)酶工程在食品工業(yè)中的應(yīng)用第60頁,共92頁，2024年2月25日，星期天生物技術(shù)對食品工業(yè)生產(chǎn)影響最大的還是酶工程和發(fā)酵工程。2001年世界酶制劑年銷售額達(dá)16億美元，2008年銷售額達(dá)到30億美元。我國酶制劑的主要應(yīng)用領(lǐng)域是食品工業(yè)，全世界食品工業(yè)用酶約占總量的60%，我國更高達(dá)85%以上。如應(yīng)用于酒精、味精、有機(jī)酸、啤酒、淀粉糖、果汁、肉、蛋、豆、奶、面制品加工等許多工業(yè)領(lǐng)域，創(chuàng)造工業(yè)附加值數(shù)千億元。第61頁,共92頁，2024年2月25日，星期天

一、改進(jìn)啤酒生產(chǎn)工藝，提高啤酒質(zhì)量

傳統(tǒng)的啤酒生產(chǎn)主要依靠麥芽中的α、β-淀粉酶的水解作用，生成麥芽糖，進(jìn)而發(fā)酵過濾等，又稱全麥啤酒。其生產(chǎn)過程緩慢，效率低，難以適應(yīng)現(xiàn)代化的要求，正逐步向外加酶制劑的方向發(fā)展。第62頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（一）固定化生物催化劑釀造啤酒新工藝?yán)霉潭ɑ负凸潭ɑ?xì)胞技術(shù)釀造酒是近年來國外啤酒工業(yè)的新工藝。固定化的方法主要有下述兩種：一種是以藻朊酸作為交聯(lián)劑通過與酶共價(jià)結(jié)合起來，再把微生物細(xì)胞包埋進(jìn)去；另一種是將干燥的微生物酵母細(xì)胞懸浮在酶液中，使兩者充分混合，脫水后加戊二醛和鞣酸（單寧）使兩者結(jié)合起來。第63頁,共92頁，2024年2月25日，星期天前蘇聯(lián)專家把酵母細(xì)胞鑲嵌在陶瓷或聚乙烯材料的環(huán)形載體上(直徑為10-20mm)進(jìn)行啤酒發(fā)酵，發(fā)酵周期縮短到2d，鮮啤酒的理化指標(biāo)均可達(dá)到傳統(tǒng)工藝水平，但產(chǎn)量比傳統(tǒng)工藝增加2～2.5倍。上海微生物研究所和上海華光啤酒廠把卡伯爾酵母固定化后用于啤酒釀造，試驗(yàn)表明，啤酒的主發(fā)酵時(shí)間可以控制在24h以內(nèi)，后酵時(shí)間縮短到7d左右，比傳統(tǒng)工藝縮短一半以上，釀成的啤酒口味純正、泡沫性良好，各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)。第64頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（二）

固定化酶用于啤酒澄清啤酒中含有多肽和多酚物質(zhì)，在長期放置過程中，會(huì)發(fā)生聚合反應(yīng)，使啤酒變混濁。在啤酒中添加木瓜蛋白酶等蛋白酶，可以水解其中的蛋白質(zhì)和多肽，防止出現(xiàn)混濁。但是，如果水解作用過度，會(huì)影響啤酒泡沫的保持性。Witt等人（1970年）用戊二醛交聯(lián)法對木瓜蛋白酶固定化，可連續(xù)水解啤酒中的多肽。將經(jīng)預(yù)過濾的啤酒在0℃和-1℃下及一定二氧化碳壓力，通過木瓜蛋白酶的反應(yīng)柱，得到的啤酒可在長期貯存中保持穩(wěn)定。第65頁,共92頁，2024年2月25日，星期天（三）

添加蛋白酶和葡萄糖氧化酶，提高啤酒穩(wěn)定性1、添加蛋白酶提高啤酒穩(wěn)定性通過蛋白酶來降解啤酒中的蛋白質(zhì)，提高啤酒穩(wěn)定性。目前主要采用菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶。多數(shù)是在成熟啤酒過濾之前，與酒液混合進(jìn)過濾機(jī)，或者直接加入清酒罐中。每1kg固定化木瓜蛋白酶可處理啤酒1t以上，在連續(xù)式反應(yīng)器中，可連續(xù)使用3個(gè)月以上。第66頁,共92頁，2024年2月25日，星期天2、添加葡萄糖氧化酶，提高啤酒穩(wěn)定性和保質(zhì)期。啤酒中多酚類物質(zhì)的氧化不僅加速了混濁物質(zhì)的形成，而且使啤酒色澤加深，影響啤酒風(fēng)味。葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖生成葡萄糖酸，同時(shí)消耗了氧，起到了脫氧作用。葡萄糖氧化酶的存在可以去除啤酒中的溶氧和成品酒中瓶頸氧，阻止啤酒氧化變質(zhì)、防止老化、保持啤酒原有風(fēng)味、延長保質(zhì)期。實(shí)踐證明，添加葡萄糖氧化酶后的啤酒溶氧量大幅度減少，老化減輕，口感好，澄清度高，可延長保質(zhì)期1～2個(gè)月。第67頁,共92頁，2024年2月25日，星期天啤酒原料大麥中含有β-葡聚糖，含量約5％-8％。適量的β-葡聚糖是構(gòu)成啤酒酒體和泡沫的重要成分，但過多的β-葡聚糖會(huì)使麥芽汁難于過濾，降低出汁率，易使麥芽汁渾濁。同時(shí)在發(fā)酵階段，過量的β-葡聚糖可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使啤酒酵母產(chǎn)生沉降，影響發(fā)酵的正常進(jìn)行。如果成品啤酒β-葡聚糖含最超標(biāo)，容易形成霧濁或凝膠沉淀，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量。（四）葡聚糖酶提高啤酒的持泡性第68頁,共92頁，2024年2月25日，星期天雙乙酰即丁二酮（CH3COCOCH3）的含量多少是影響啤酒風(fēng)味的重要因素，是品評啤酒是否成熟的主要依據(jù)，在一定程度上決定著啤酒的質(zhì)量，雙乙酰由α-乙酰乳酸經(jīng)非酶氧化脫羧形成，是啤酒酵母在發(fā)酵過程中形成的代謝副產(chǎn)物。一般成品啤酒的雙乙酰含量不得超過0.1mg/L，否則會(huì)使啤酒帶有不愉快的餿味。α-乙酰乳酸脫羧酶可使α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為3—羥基丙酮，改變了α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化途徑，從而有效地降低啤酒中雙乙酰的含量，加快啤酒的成熟。（五）

降低啤酒中雙乙酰含量第69頁,共92頁，2024年2月25日，星期天與普通啤酒相比，干啤酒具有發(fā)酵度高、殘?zhí)橇康汀崃康?，干爽及飲后無余味等特點(diǎn)。啤酒生產(chǎn)主要原料麥芽中含淀粉55％-65％，輔料大米含淀粉71％-73％，這些淀粉主要依靠麥芽自身的α-淀粉酶、β-淀粉酶的水解作用而生成以麥芽糖為主的可發(fā)酵性糖。正常麥汁中，可發(fā)酵性糖只占總糖的75％-80％，占總浸出物的65％-73％。僅靠麥芽中的酶進(jìn)行糖化，很難達(dá)到麥汁發(fā)酵度75％以上的指標(biāo)。通過添加α-淀粉酶、異淀粉酶、糖化酶、普魯蘭酶等酶制劑，可以提高發(fā)酵度，釀造干啤酒。（六）

改進(jìn)工藝，生產(chǎn)干啤酒第70頁,共92頁，2024年2月25日，星期天橘苷酶可用于分解柑橘類果肉和果汁中的柚皮苷以除去苦味，同時(shí)有效防止柑橘類罐頭食品出現(xiàn)白色渾濁；果膠酶可用于果酒、果汁的澄清；纖維素酶可將傳統(tǒng)工藝中的果皮渣進(jìn)行綜合利用，促進(jìn)果汁的提取與澄清，提高可溶性固形物含量。二、

改進(jìn)果酒、果汁飲料的生產(chǎn)工藝第71頁,共92頁，2024年2月25日，星期天蘋果經(jīng)壓榨后其果汁中仍然含較多的不溶性果膠而呈渾濁狀，通過外加酶制劑，即可澄清果汁。具體做法是在渾濁果汁內(nèi)加入果膠酶并輕輕攪拌，在酶作用下，不溶性果膠漸漸凝聚成絮狀物析出，從而可以獲得清澈的琥珀色蘋果汁。有的蘋果因果肉柔軟難以壓出果汁，添加果膠酶可大大促進(jìn)果汁的提取。通常把果肉攪拌15～30min后，直接添加0.04％果膠酶，并于45℃下處理10min，即可多產(chǎn)果汁12％～24％。還可以把纖維素酶與果膠酶結(jié)合使用，使果肉全部液化，用于生產(chǎn)蘋果汁、胡蘿卜汁和杏仁乳，產(chǎn)率高達(dá)85。（一）

果汁提取

第72頁,共92頁，2024年2月25日，星期天新壓榨出來的果汁不僅黏度大，而且渾濁。加果膠酶澄清處理后，黏度迅速下降，渾濁顆粒迅速凝聚，使果汁得以快速澄清、易于過濾。但對于橘汁，由于要求保持霧狀渾濁，所以應(yīng)使用不含果膠酶的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶制劑進(jìn)行澄清處理。通常0.1％的果膠酶處理蘋果果汁、果漿，可明顯地提高出汁率、可溶性固形物含量和透光率，降低pH值和相對黏度，處理時(shí)間越長，效果越好。0.1％的果膠酶與0.1％的纖維素酶結(jié)合使用，效果更好。（二）

果汁澄清

第73頁,共92頁，2024年2月25日，星期天果膠的存在會(huì)降低果酒的透光率，并極易產(chǎn)生渾濁和沉淀。經(jīng)果膠酶澄清處理能除去果酒中的果膠，提高果酒的穩(wěn)定性。采用傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)蘋果酒果香不足、新鮮感不強(qiáng)，將果膠酶應(yīng)用于蘋果酒釀造，并輔以其他工藝改革，不但提高出汁率10.8％～14.3％，提高果汁的過濾效率，縮短蘋果酒的貯存期，提高設(shè)備利用率，進(jìn)而使蘋果汁透光率由30.1％提高到71.5％，釀出的蘋果酒果香清新、典型性好。

（三）果酒澄清、過濾第74頁,共92頁，2024年2月25日，星期天常見的保鮮技術(shù)主要有添加防腐劑或保鮮劑和冷凍、加熱、干燥、密封、腌制、煙熏等。酶法保鮮的原理：利用酶的催化作用，防止或消除外界因素對食品的不良影響，在較長時(shí)間內(nèi)保持食品原有的品質(zhì)和風(fēng)味。目前應(yīng)用較多的是葡萄糖氧化酶和溶菌酶的酶法保鮮。三、食品保鮮第75頁,共92頁，2024年2月25日，星期天葡萄糖氧化酶可催化葡萄糖與氧反應(yīng)，生成葡萄糖酸，有效地防止食品成分的氧化作用。葡萄糖氧化酶可以在有氧條件下，將蛋類制品中的少量葡萄糖除去，而有效地防止蛋制品的褐變。葡萄糖氧化酶在pH值3.5-6.5的條件下，具有很好的穩(wěn)定性，最適pH值5.6，當(dāng)pH值大于8.0或小于2.0時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶的失活。固體葡萄糖氧化酶酶制劑在-15℃可保存8年，在0℃可保存2年以上，但當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，活力下降。（一）

利用葡萄糖氧化酶保鮮第76頁,共92頁，2024年2月25日，星期天食品在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏保存過程中，氧的存在容易引發(fā)色、香、味的改變。如花生、奶粉、餅干、冰淇淋、油炸食品等富含油脂食品的氧化，導(dǎo)致油脂的酸敗，降低營養(yǎng)價(jià)值，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)；使受損傷的蘋果、梨、馬鈴薯等水果蔬菜及草莓醬、蘋果醬、肉類等變色，影響商品質(zhì)量。加入葡萄糖氧化酶可防止食品的氧化變質(zhì)的作用。含有葡萄糖氧化酶的吸氧保鮮袋也已在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。1、食品的除氧保鮮

第77頁,共92頁，2024年2月25日，星期天蛋制品主要有蛋白片、蛋白粉和全蛋粉等，是生產(chǎn)糕點(diǎn)和糖果的原料。在蛋類蛋白中含有0.5％～0.6％的葡萄糖，葡萄糖的羰基與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，使蛋白出現(xiàn)褐變、小黑點(diǎn)，使加工產(chǎn)品色澤加深、溶解度降低并有不愉快氣味，必須除去蛋白中的葡萄糖。將一定量的葡萄糖氧化酶加到蛋白液或全蛋液中，并適當(dāng)配合一定量的過氧化氫酶，即可使葡萄糖完全氧化，除去蛋白中的葡萄糖。2、蛋類制品的脫糖保鮮第78頁,共92頁，2024年2月25日，星期天加熱殺菌和添加化學(xué)防腐劑等是防止食品腐敗的常用方法。溶菌酶（Lysozyme）是一種專門作用于微生物細(xì)胞壁的水解酶，又稱細(xì)胞壁溶解酶。溶菌酶對人體無害，用一定濃度的溶菌酶處理食品，可有效防止細(xì)菌對食品的污染。既節(jié)省冷凍保鮮的高昂的設(shè)備投資，又可防止鹽腌、干制引起產(chǎn)品風(fēng)味的改變，簡單實(shí)用。在干酪、香腸、奶油、鮮奶或奶粉中加入一定量的溶菌酶，可防止微生物污染，延長貯藏時(shí)間。（二）

利用溶菌酶保鮮第79頁,共92頁，2024年2月25日，星期天食糖是日常生活必需品，也是食品、醫(yī)藥等工業(yè)原料。世界食糖的需求每年以4％的速率增加，而產(chǎn)量每年只增加2％-3％，供不應(yīng)求。目前各國都競相生產(chǎn)高果糖漿（甜度為蔗糖的173.5％）。在美國、日本等發(fā)達(dá)國家2/3的食糖已為高果糖漿代替。高果糖漿采用固定化葡萄糖異構(gòu)酶和固定化含酶菌體進(jìn)行生產(chǎn)。四、利用固定化酶生產(chǎn)高果糖漿第80頁,共92頁，2024年2月25日，星期天高果糖漿的生產(chǎn)工藝葡萄糖異構(gòu)酶第81頁,共92頁，2024年2月25日，星期天五、酶法生產(chǎn)新型低聚糖國際市場低聚糖年總產(chǎn)量達(dá)6萬t，已廣泛應(yīng)用于飲料、糖果、糕點(diǎn)、乳制品、冷飲、調(diào)味料，療效食品等產(chǎn)品中主要有：異麥芽寡糖、蔗果寡糖、半乳糖基寡糖、半乳糖基轉(zhuǎn)移寡糖、帕拉金糖、偶合糖、大豆低聚糖、異構(gòu)乳糖等。低聚糖的主要生理功能：促進(jìn)雙歧桿菌增殖；抑制腐敗菌的生長繁殖；低熱能，防止肥胖和糖尿病、抗齲齒、抗腫瘤等。第82頁,共92頁，2024年2月25日，星期天又稱為蔗果寡糖，其分子結(jié)構(gòu)是在蔗糖(GF)分子上結(jié)合l～3個(gè)果糖分子的寡糖的總稱。主要有：蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)，蔗糖與果糖分子以β-l，2糖苷鍵連接普遍存在于高等植物中，尤其以洋蔥、牛蒡、蘆筍、香蕉等植物中含量較高。目前工業(yè)上用β-果糖轉(zhuǎn)移酶（為胞內(nèi)酶，來自于黑曲霉）作用于蔗糖，進(jìn)行分子間果糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)低聚糖。(一)低聚果糖的生產(chǎn)第83頁,共92頁，2024年2月25日，星期天直鏈麥芽糖分子中具有分支狀鍵合的寡糖，因此又稱為分支低聚糖。分子中除了α-1，4糖苷鍵以外，尚含有α-1，