質(zhì)粒提取鑒定

質(zhì)粒提取鑒定

質(zhì)粒含有某些染色體所沒有的基因，編碼某些功能蛋白質(zhì)（表達(dá)某種遺傳性狀，如抗藥性（抗氨卞青霉素、抗四環(huán)素等），耐受重金屬，產(chǎn)生細(xì)菌素等等）。即很多質(zhì)粒往往都賦予其宿主細(xì)胞一定的表型。

第2頁,共32頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒DNA提取、鑒定

暨大醫(yī)學(xué)院生化系蔣建偉第3頁,共32頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒分類：

嚴(yán)緊型（每個(gè)細(xì)胞1－5個(gè)質(zhì)粒）質(zhì)粒的復(fù)制與宿主染色體復(fù)制同步進(jìn)行，因而一個(gè)宿主細(xì)胞中只有一個(gè)或幾個(gè)質(zhì)?？截悺．?dāng)宿主蛋白合成被抑制，染色體復(fù)制停止，質(zhì)粒的復(fù)制也停止；松弛型（每個(gè)細(xì)胞10－200個(gè)質(zhì)粒）質(zhì)粒的復(fù)制受“松弛型控制”。當(dāng)宿主蛋白質(zhì)合成受抑制（如加入氯霉素），染色體復(fù)制停止時(shí)，質(zhì)粒仍可大量復(fù)制。此時(shí)，一個(gè)宿主細(xì)胞中質(zhì)粒數(shù)目可多至數(shù)千個(gè)拷貝。第4頁,共32頁，2024年2月25日，星期天具備基因工程質(zhì)粒載體的條件：①多克隆位點(diǎn)（multiplecloningsite,MCS),一段短的序列上有多種限制性內(nèi)切酶切口，每種只有一個(gè)切口。②選擇性標(biāo)記，如抗藥性。③本身分子量不宜過大，有一定容量。④有一定的copynumber——每個(gè)宿主菌可能容納的最多質(zhì)粒數(shù)。第5頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

pBR322質(zhì)粒(4.36kp),最早應(yīng)用于基因工程的載體，現(xiàn)在仍在廣泛應(yīng)用。?序列已全部清楚?數(shù)十個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)?2個(gè)抗藥基因第6頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

pBR322質(zhì)粒(4363bp):

主要包括：①限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（插入外源基因）；②含有terr、ampr抗藥基因，可作為篩選標(biāo)志。③含有復(fù)制起始點(diǎn)ori（賦予其復(fù)制特性）。第7頁,共32頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共32頁，2024年2月25日，星期天pUC18/19pUC載體系列是由大腸桿菌pBR322質(zhì)粒與Ｍ13噬菌體改建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。質(zhì)粒含有LacZ的N端146個(gè)AA殘基的編碼基因，編碼產(chǎn)物為β半乳糖苷酶的α片段。

Lac－E.coli（突變型宿主細(xì)胞）：可表達(dá)該酶的ω片段.單獨(dú)存在的α或ω片段均無活性，只有宿主細(xì)胞與克隆載體同時(shí)共表達(dá)兩片段，宿主細(xì)胞才有β半乳糖苷酶活性，使特異底物產(chǎn)生藍(lán)色化合物（α-互補(bǔ))。第9頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

α互補(bǔ)的檢測α片段ω片段α片段ω片段第10頁,共32頁，2024年2月25日，星期天本次實(shí)驗(yàn)用pEC-CTpEC-CT在pcDNA3基礎(chǔ)上構(gòu)建pEC-ct質(zhì)粒：8.0kb

有HindⅢ,BamHⅠ酶切點(diǎn)，可切出CD基因（1.2kb）第11頁,共32頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒DNA提取和純化步驟：培養(yǎng)細(xì)菌收集和裂解細(xì)菌純化質(zhì)粒DNA第12頁,共32頁，2024年2月25日，星期天接種：從-20℃取出菌種，斜面劃線接種，37℃培養(yǎng)24h單克隆培養(yǎng)：挑單個(gè)菌落，接種于LB培養(yǎng)液中（含Amp50μg/ml)4-6h。菌液0.2ml＋10mlLB培養(yǎng)基（含Amp50μg/ml)37℃培養(yǎng)過夜。細(xì)菌的培養(yǎng)

第13頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3.擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)液3ml,接種于60mL的LB培養(yǎng)液（含Amp50μg/ml),振搖200rpm，37℃(4-6h),使A580＝0.4-0.6。4.加氯霉素：加氯霉素，終濃度40μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)15-17h.第14頁,共32頁，2024年2月25日，星期天本次實(shí)驗(yàn)包括：1.菌體收集2.菌體裂解、質(zhì)粒DNA提取、純化3.鑒定2人一組第15頁,共32頁，2024年2月25日，星期天1.取8個(gè)1.5mlEppendorf管，分別加入細(xì)菌培養(yǎng)液1.4ml↓9000rpm2-3min

↓↘棄上清2.600μlSTE液依次溶解各管沉淀，合并一管再用200μlSTE液清洗各管，清洗液合并一管（收集菌體）↓

9000rpm2-3min,棄上清（保留菌體）收集菌體600ul第16頁,共32頁，2024年2月25日，星期天3.沉淀懸于200ul溶液I，槍頭吹打混勻

↓放置3min

4.加入400ul溶液II，顛倒EP管20～30次（動(dòng)作輕!?。?/p>

II：0.2NNaOH-1%SDS↓放置5min5.加入300ul溶液III，充分混勻（溫和操作）↓

10min

沉淀蛋白質(zhì)和染色體DNAIII：3M醋酸鉀/2M醋酸。裂解堿裂解法提取質(zhì)粒DNAI：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；RNase第17頁,共32頁，2024年2月25日，星期天溶液I成分：50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；Tris-Cl溶液：控制溶液的pH，50mM葡萄糖：使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。EDTA：是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長第18頁,共32頁，2024年2月25日，星期天溶液II成份：0.2NNaOH/1%SDS；

NaOH：溶解細(xì)胞。之所以叫堿裂解法，因NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，都會(huì)在瞬間溶解，細(xì)胞從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的變化。

SDS：破壞膜系統(tǒng)。第19頁,共32頁，2024年2月25日，星期天加溶液II要記住兩點(diǎn)：

1.時(shí)間不能過長，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；2.操作必須溫柔，不然基因組DNA也會(huì)斷裂。基因組DNA的斷裂會(huì)混入質(zhì)粒DNA中，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。

第20頁,共32頁，2024年2月25日，星期天溶液III成份：

3M醋酸鉀/2M醋酸

等電點(diǎn)沉淀。

中和NaOH，長時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和。第21頁,共32頁，2024年2月25日，星期天12000rpm3min

↓↘棄沉淀

6.將上清轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，加0.6倍體積異丙醇(540ul

)，顛倒混勻↓室溫5min

離心12000rpm10min↓↘棄上清沉淀干燥，室溫10min↓7.加TE500ul溶解沉淀同時(shí)倒膠1%,330ml/小班沉淀質(zhì)粒第22頁,共32頁，2024年2月25日，星期天SDS-醋酸鉀沉淀的形成不能將所有的蛋白質(zhì)沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。第23頁,共32頁，2024年2月25日，星期天8.加入等體積飽和酚，振搖1min，充分混勻↓12000rpm5min9.將上層水相轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，用等體積氯仿-異戊醇抽提，振搖1min，充分混勻↓12000rpm5min10.將上層水相轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，加入預(yù)冷的2.5倍體積無水乙醇↓-20℃30min純化質(zhì)粒易錯(cuò)第24頁,共32頁，2024年2月25日，星期天酚/氯仿/異丙醇酚：蛋白質(zhì)的變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，可最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是在高濃度的鹽溶液中，離心后酚會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；我們單獨(dú)用酚抽提酚，會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），因此用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。第25頁,共32頁，2024年2月25日，星期天

離心12000rpm10min↓↘棄上清沉淀干燥↓11.加入TE25-30ul,溶解沉淀（反復(fù)吹打至完全溶解）

EP管上做記號(hào)第26頁,共32頁，2024年2月25日，星期天質(zhì)粒的分離、純化半定量檢測濃度酶切電泳鑒定第27頁,共32頁，2024年2月25日，星期天鑒定質(zhì)粒提取質(zhì)粒、單酶切、雙酶切樣本一起電泳，與marker比較，估計(jì)質(zhì)粒大小。線性化（單酶切）：

用HindⅢ將質(zhì)粒酶切、電泳，估計(jì)其分子大小。雙酶切：

用HindⅢ和BamHⅠ將質(zhì)粒pEC-CT所含的CD基因1.2kb片段切出。第28頁,共32頁，2024年2月25日，星期天鑒定

(質(zhì)粒分子量、純度及是否含有所需要DNA段)(一)酶解雙酶切體系：單酶切體系：sample

5ul

sample

5ulBamHⅠ1ulHindⅢ1ulHindⅢ1ul10×buffer2.5ul10×buffer2.5ul

ddH2O

15ulddH2O

15ul混勻，離心(瞬時(shí))，37℃２ｈ第29頁,共32頁，2024年2月25日，星期天13.DNA濃度測定

溴乙錠熒光法(半定量法，