動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課件

動(dòng)物病毒學(xué)試驗(yàn)技術(shù)楊潤德動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

通過病毒學(xué)的學(xué)習(xí)，我們了解到病毒沒有完整的酶系統(tǒng)，體內(nèi)無核糖體等細(xì)胞器，因此不能在任何無生命的培養(yǎng)液中生長。所以要想增殖病毒必須在有生命的組織細(xì)胞內(nèi)接種讓其增殖，如：動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞、器官。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)一、雞胚接種

發(fā)育中的雞胚是病毒生長良好的環(huán)境，被廣泛用于病毒（特別是禽病毒）的分離培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)等。

病毒在雞胚中的生長可以通過幾種方法加以測定，如：采集尿囊液、羊水、絨尿膜、雞胚作定量檢定；采集以上樣品作血凝滴定、血清學(xué)試驗(yàn)等；檢查各部的病理學(xué)變化，如：雞胚死亡、矮小、出血、羽毛發(fā)育不良、內(nèi)臟壞死灶、絨尿膜水腫或增厚、壞死性痘斑、出血。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

除雞胚外，根據(jù)病毒特點(diǎn)可以選用其他禽胚，如小鵝瘟病毒宜接種鵝胚，鴨瘟宜接種鴨胚等。

影響病毒在雞胚中生長的因素，包括雞胚的日齡、接種途徑、接種劑量、接種濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)溫度一般為35.5-37℃，有些病毒所需的溫度更低。但很多哺乳動(dòng)物病毒不適合在雞胚中生長。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.選取SPF雞群所產(chǎn)的蛋；

2.受精卵在10℃左右保存不超過10d；

3.最好選擇白色卵殼的受精卵；

4.卵殼無污染，孵化前在0.1%的新潔爾滅中浸泡約15min，最后用冷水沖洗，放卵架，或?qū)⒙逊怕鸭苡眉兹?m2用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸時(shí)維持箱內(nèi)溫度為37℃20min后驅(qū)散甲醛蒸汽；

5.孵化溫度保持39-40℃，相對濕度60-65%，有風(fēng)扇維持空氣流通，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的質(zhì)量和孵化動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

根據(jù)不同病毒的嗜性，選擇適宜的接種途徑。最常用的途徑有卵黃囊、尿囊腔、尿囊膜3種途徑，偶爾接種于羊膜腔、靜脈、胚體等。在分離一種未知病毒時(shí)，最好3種途經(jīng)均用，如果沒有足夠的受精卵，首選絨尿膜接種途徑，因?yàn)榇蠖鄶?shù)病毒都能適應(yīng)。接種材料的處理：將組織置研缽磨碎，加5-10倍鹽水并加入雙抗混均，2000-3000r/min離心20-30min。取上清待用。二、接種途徑動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

卵黃是胚胎的營養(yǎng)物質(zhì)，卵黃囊膜是由內(nèi)胚層發(fā)育而來的，內(nèi)層覆有一層絨毛。病毒可在絨毛細(xì)胞內(nèi)生長，并且可以由此擴(kuò)散到胚胎的其他部位。

㈠卵黃囊動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.取5-8日齡雞胚，在照卵器上畫出氣室和胚胎的位置；

2.直立于卵座上，于氣室部碘酊消毒后打孔；

3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黃吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出針頭封口。放孵化器中繼續(xù)孵化，每天照卵2-3次。接種方法動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

尿囊是雞胚的排泄器官。腔內(nèi)充滿排泄物尿囊液。液體的容量因卵的大小而異，一般6日齡雞胚時(shí)約1ml，11日齡時(shí)約6ml，13日齡可高達(dá)10ml，以后逐漸減少直到消失。13日齡時(shí)的尿囊液是無色透明的，14日齡后逐漸變渾濁，呈乳白色，有時(shí)淡黃色。㈡尿囊腔接種動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.取9-10日齡雞胚，照卵，畫出氣室，離氣室邊緣0.3-0.5cm用鉛筆作一記號(hào)；

2.在氣室做記號(hào)處用碘酊消毒，打孔；

3.用注射器取毒液自接種孔斜刺入約1cm，注入毒液0.1-0.2ml；

4.封孔繼續(xù)孵化，定時(shí)照蛋。接種方法動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

絨尿膜是雞胚的呼吸器官，由尿囊膜和絨毛膜緊密粘合組成，無法分開。絨尿膜上有豐富的血管，照蛋時(shí)清晰可見。㈢絨尿膜接種動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

方法一將待檢液滴在氣室膜上，透過卵膜擴(kuò)散到絨尿膜上。原理是氣室卵膜性脆，刺破后不再閉合，而絨尿膜是活組織，有韌性刺破后能立即閉合，接種液不能透過。接種方法動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1.取9-10日齡雞胚，照卵器畫出氣室范圍；

2.將卵直立于卵架上，氣室向上，于中央消毒打孔；

3.以1ml注射器配以2.5cm5-6號(hào)針頭，自小空刺入氣室約0.5cm，滴加待檢液0.1-0.2ml于氣室內(nèi)的卵膜上，將針頭繼續(xù)垂直刺入，拔出針頭，封口，繼續(xù)孵化定時(shí)翻蛋?？呻S意放置。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

方法二此法做人工氣室，能保證毒液接種在絨尿膜上。

1.取9-10日齡雞胚，畫出氣室及胚胎位置中的無血管區(qū)；

2.將卵橫臥于卵架上，胚胎位置向上；

3.在胚胎部位及氣室部碘酊消毒，氣室中央打孔，胚胎部位用鋼鋸劃破卵殼但不破壞絨尿膜；

動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)4.用橡皮吸球吸氣室部的空氣，使卵內(nèi)容物移向氣室，促使破殼部位的絨尿膜下陷，形成人工氣室；

5.自人工氣室接種待檢物0.1-0.2ml；

6.將卵殼移回原位或用滅菌玻璃紙封口用膠布固定；

7.將卵放回孵卵箱繼續(xù)孵育，人工氣室向上，每日檢卵2-3次。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)㈠檢查雞胚接種待檢材料后孵化1-6d，此期間每天最少檢卵2次。接種24h死亡胚一般視為非特異性死亡，棄去。以后死亡胚立即取出放置4℃內(nèi)至少4h，以使血管收縮。冷藏時(shí)間不得超過24h，否則胚液蒸發(fā)，氣室卵膜難于剝離，影響病毒的收獲。三、雞胚接種后的檢查和收獲動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)㈡雞胚內(nèi)容物的收獲

1.尿囊液的收獲⑴將卵直立于卵架上，氣室向上；⑵氣室部碘酊消毒，擊破并除去卵殼；⑶用滅菌鑷子撕去氣室部的卵膜及絨尿膜，可見尿囊液澄清透明；⑷用吸管或注射器采集尿囊液，菌檢棄去細(xì)菌污染的尿囊液。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)2、羊水的收獲

⑴1-4與尿囊液的收獲一樣；⑵吸取尿囊液后用鑷子提起羊膜，用細(xì)吸管刺入羊膜腔吸取羊水。

3、絨尿膜的收獲⑴1-3與尿囊液收獲相同；⑵用小剪刀剪取氣室部的絨尿膜，觀察病變并收獲；⑶吸取尿囊液，將卵黃倒入平皿，剪斷卵帶收取絨尿膜低溫保存。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)4.卵黃囊的收獲⑴1-4與尿囊膜的收獲同；⑵將卵內(nèi)容物全部倒入平皿中；⑶用鑷子夾住卵黃帶，剪斷，將卵黃囊提起，置于另一平皿內(nèi)，刺破卵黃囊，用生理鹽水洗去卵黃，將卵黃囊低溫保存。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)二、細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞非常嬌嫩，在體外培養(yǎng)時(shí)生長液中不能含有任何對細(xì)胞有害的物質(zhì)，而且與細(xì)胞接觸的玻璃器皿應(yīng)不含有任何對細(xì)胞有害的物質(zhì)。目前市場上有滅菌的一次性使用的96孔、24孔、12孔板及細(xì)胞培養(yǎng)瓶。在研究病毒時(shí)要大量增殖病毒，一次性瓶太昂貴，因此要求使用玻璃器皿，但它要經(jīng)過洗滌與消毒后方可使用，并可重復(fù)使用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、玻璃器皿的清洗在組織培養(yǎng)中工作量最大的莫過于清洗玻璃器皿。清洗的玻璃器皿要求干凈透明、無油漬，而且不能含有任何毒性物質(zhì)，毒性物質(zhì)包括解體的微生物、細(xì)胞殘余物以及非營養(yǎng)性的化學(xué)物質(zhì)，有些化學(xué)物質(zhì)僅百萬分之一毫克，就會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，因此新購置的以及使用過的器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的清洗。一、器材的洗滌與消毒動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

⑴浸泡新購置的玻璃器皿其上帶有干固的灰塵，同時(shí)生產(chǎn)的原因，使其常呈堿性并帶有毒性物質(zhì)如：鋁和砷等，所以使用前用5%鹽酸浸泡，以中和其中的堿便于清洗。用過的器皿往往有大量的蛋白質(zhì)附著，用后立即清洗浸泡。⑵刷洗浸泡后的器皿于洗滌劑中用毛刷洗去玻璃上的雜質(zhì)。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)⑶酸浸刷洗不掉的極微量的雜質(zhì)，經(jīng)過清潔液浸泡的強(qiáng)氧化作用被除掉。清潔劑對玻璃器皿無腐蝕作用。去污十分有效，是清潔過程中關(guān)鍵的一環(huán)。清潔液使用重鉻酸鉀、濃硫酸、水按一定比例配制而成，浸泡時(shí)溶液要充滿容器，不要留有空氣。配制時(shí)，要將重鉻酸鉀溶于水中，再緩慢加入硫酸，加硫酸時(shí)不要過急，因其產(chǎn)熱過大，會(huì)有危險(xiǎn)，清潔液呈棕紅色，遇有機(jī)溶劑或水分增多時(shí)變綠，失效。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

強(qiáng)

次強(qiáng)

弱重鉻酸鉀63g120g100g硫酸1000ml200ml100ml水200ml1000ml1000ml動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)⑷沖洗酸浸后用水充分沖洗用洗滌劑徹底清洗，不留任何殘跡，至少每瓶用水灌滿倒掉重負(fù)12次，再用蒸餾水沖洗3次，雙蒸水沖洗3-5次晾干備用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)2、朔料器皿的清洗先用清水浸泡沖洗，用2%NaOH浸泡過夜，自來水沖洗，再用5%鹽酸浸泡30min，自來水沖洗，蒸餾水沖洗3次晾干，用70-75%乙醇沖洗37℃晾干備用。

3、膠塞的清洗用水浸泡，2%NaOH煮沸10-20min，自來水沖洗，再用1%鹽酸浸泡30min，流水沖洗，蒸餾水漂洗，晾干備用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

組織培養(yǎng)最重要的是防止微生物污染：其來源①組織已受污染；②操作時(shí)空氣流動(dòng)；③操作者的疏忽；④培養(yǎng)用具消毒不嚴(yán)。因此組織培養(yǎng)一定要嚴(yán)格消毒措施。消毒隨物品的不同采用不同的方法：物理滅菌法化學(xué)滅菌法二、消毒動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、紫外線：對空氣、朔料器皿，消毒效果與距離密切相關(guān)，一般維持30min。2、干熱滅菌法3、濕熱滅菌法4、過濾除菌5、消毒劑，來蘇、新潔爾滅、乙醇是最好的消毒劑。用來消毒桌、椅、天花板、地板，操作者的皮膚，乳酸對空氣消毒十分有效。6、包裝。其目的是防止再次污染。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、HanK’s液2、乳漢液3、0.4%酚紅：酚紅0.4g，0.1mol/LNaOH2.85ml，將酚紅于乳缽中，加入NaOH研磨至全部溶解，加去離子水至100ml，裝瓶滅菌備用。4、0.25%胰蛋白酶，用無鈣鎂離子的磷酸鹽平衡鹽水配制，并用NaHCO2將PH值調(diào)至7.8，過濾除菌分裝備用。三、溶液的配制動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)0.02%EDTA液，商品名為Versene，是一種螯合劑，與鈣鎂離子形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而使組織細(xì)胞松散，常用于使細(xì)胞從玻面脫落。配制方法，EDTA0.2g加無鈣鎂磷酸鹽平衡鹽水1000ml，溶解后分裝，高壓滅菌備用。有時(shí)0.25%胰酶與0.02%EDTA等量混合，消化效果更好。5、199、1640、MEM、DMEM按說明書配制。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)6、犢牛血清，其含10多種氨基酸、激素、無機(jī)鹽類及一些未知成分。不加血清的營養(yǎng)液，細(xì)胞不能貼壁，且生長不良。使用前56℃滅活30min，加入的量因細(xì)胞種類不同而異，5-10%。7、抗生素，①青、鏈霉素，配制成1萬單位或1萬μg/ml，使用時(shí)在營養(yǎng)液中加入1%。②慶大、卡那霉素，廣譜抗菌素，抗霉形體且穩(wěn)定，能耐高壓滅菌，營養(yǎng)液濃度50-100μg/ml。③制霉菌素、兩性霉素，配制成1000μg/ml-20℃保存，使用劑量為5-10μg/ml，視細(xì)胞耐受程度調(diào)節(jié)。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

應(yīng)用胚胎或幼小動(dòng)物的組織制備培養(yǎng)，因其分裂旺盛，易生長。各種動(dòng)物的大多數(shù)組織都能在體外培養(yǎng)，最常用的有腎、睪丸、肺、皮膚等。本試驗(yàn)以雞胚為例：1、取10-11日齡雞胚，氣室部消毒，用無菌鑷擊破蛋殼，除去卵殼、卵膜；2、將雞胚移入無菌平皿中，用無菌剪、鑷去頭、腳、翅、內(nèi)臟、眼睛，用Hank,s也洗2次，移入三角瓶中，剪成1-2mm2小塊用Hank,s洗3次。四、原代細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)3、按3-5倍加入胰酶，于37℃作用30min，每10min搖一次，靜置后棄去胰酶。洗2次加入含血清的營養(yǎng)液或乳漢液，吹打數(shù)次。4、用2層或4層紗布過濾于離心管中，800轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取沉淀。5、按1：200-250加入營養(yǎng)液分裝培養(yǎng)瓶或96孔板，于37℃靜置培養(yǎng)。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)五、傳代細(xì)胞培養(yǎng)由于遺傳突變或在理化學(xué)物質(zhì)的作用下，組織細(xì)胞中有時(shí)出現(xiàn)惡性變細(xì)胞，即癌變細(xì)胞。這種癌變細(xì)胞具有很高的生長和增殖勢能，而且?guī)缀蹩梢詿o限傳代。固稱傳代細(xì)胞系。其染色體已經(jīng)發(fā)生改變，不再是二倍體細(xì)胞，故稱異倍體細(xì)胞。有人體或動(dòng)物體取得腫瘤組織進(jìn)行培養(yǎng)，比較容易獲得傳代細(xì)胞系。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

傳代細(xì)胞的傳代，將長滿單層的細(xì)胞用消化液洗3次，消化細(xì)胞并使其從瓶壁上脫落下來，敲打細(xì)胞培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞分散，加入2-3倍的營養(yǎng)液，分裝細(xì)胞培養(yǎng)瓶，靜置培養(yǎng)。待長成單層待用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)三、病毒的接種及檢查

不同病毒接種于細(xì)胞的時(shí)間不同①待細(xì)胞生長成單層后接種病毒；②細(xì)胞分裝培養(yǎng)12h后接種病毒；③病毒與細(xì)胞同步接種培養(yǎng)。1、將病料制成1：10勻漿，加入雙抗，3000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘或15000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，取上清待接種。2、取不同生長時(shí)期的細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，按1：10接種病毒材料37℃吸附1/2-2h，使病毒吸附于細(xì)胞膜上。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)3、棄去病毒液，加入維持液，于37℃靜置培養(yǎng)。4、逐日在顯微鏡下檢查CPE，或進(jìn)行其他試驗(yàn)。接種病毒2天后，如維持液混濁，說明有細(xì)菌污染，棄去。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)四、空斑形成技術(shù)1952年創(chuàng)立該試驗(yàn)方法，將10倍梯度稀釋的病毒樣本分別接種于單層細(xì)胞，而后在細(xì)胞上覆蓋一層含營養(yǎng)液的瓊脂，以防止游離病毒通過營養(yǎng)液擴(kuò)散，但病毒可在細(xì)胞間傳遞。經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，進(jìn)行染色感染病毒的細(xì)胞會(huì)形成一個(gè)近似圓形的斑點(diǎn)，類似固體培養(yǎng)基上的菌落，稱為空斑或蝕斑。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

空斑是細(xì)胞病變的一種特殊表現(xiàn)形式。一個(gè)空斑可能有一個(gè)以上病毒顆粒感染所致，因此可將獲得的單個(gè)空斑制成懸液，梯度稀釋后再作空斑，最終可以獲得只含有一個(gè)病毒顆粒及子代的空斑，這就是病毒克隆。

動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、測定病毒液中病毒的含量（PFU計(jì)）。2、可以用來測定某病毒的特異性抗體及抗體效價(jià)。如：新城疫病毒稀釋10-6，每毫升病毒液含100個(gè)PFU，即稀釋液0.1ml含10個(gè)PFU，取培養(yǎng)好的細(xì)胞5瓶分別接種0.1ml的病毒稀釋液，其中4瓶加入不同稀釋倍數(shù)的血清，根據(jù)空斑形成的多少測定出抗體的有無及抗體的效價(jià)。3、可以獲得病毒的純培養(yǎng)物。空斑技術(shù)的利用可以達(dá)到的目的：動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)4、不同病毒形成的空斑在大小、形態(tài)（規(guī)則的圓形、欠規(guī)則的圓形、完全透明或不完全透明）、形成時(shí)間等可以有所不同，該特點(diǎn)有助于識(shí)別病毒，并可以此研究病毒的遺傳變異。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、將細(xì)胞培養(yǎng)于扁瓶或平皿中，使其長成密集的單層，不能有空隙，吸去生長液，洗2次2、病毒用Hank,s液，做10倍連續(xù)稀釋，每個(gè)稀釋度接種2個(gè)培養(yǎng)瓶；3、37℃吸附60min，每15min轉(zhuǎn)動(dòng)一次；檢查空斑形成的基本過程：動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)4、加入融化冷卻至45℃的營養(yǎng)瓊脂覆蓋單層①2×營養(yǎng)液﹢2%瓊脂混均（8ml）加在細(xì)胞的對面，翻轉(zhuǎn)，37℃培養(yǎng)，根據(jù)接種病毒的不同，決定加入第二層的時(shí)間（48-72h2×營養(yǎng)液﹢2%瓊脂﹢1：1000中性紅，100μg/ml混均7ml。加入的二層后繼續(xù)培養(yǎng)，肉眼觀察，空斑淡白色、背景淡紅色。②2×營養(yǎng)液﹢2%瓊脂﹢1：1000中型紅，100μg/ml混均，將其加入細(xì)胞的對面翻轉(zhuǎn)避光培養(yǎng)。逐日觀察。

動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、瓊脂的質(zhì)量是空斑技術(shù)的關(guān)鍵，要使用高級瓊脂或瓊脂糖；2、瓊脂融化后放50℃水浴；3、只要細(xì)胞不衰老，培養(yǎng)時(shí)間盡量延長，使空斑充分發(fā)育；4、中性紅對細(xì)胞有毒性作用，因此可用2步法或培養(yǎng)后用0.01%中性紅染色37℃2h；5、中性紅是光敏活體染料，感染細(xì)胞在可見光下培養(yǎng)不能產(chǎn)生正常空斑。觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，觀察時(shí)間不宜過長，中性紅現(xiàn)用現(xiàn)配。注意事項(xiàng)：動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)五、病毒感染力的測定

感染力即毒力，可以用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或雞胚測定其半數(shù)致死量（LD50）或半數(shù)感染量（EID50）；另外可以使用組織培養(yǎng)細(xì)胞測定半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量（TCID50）。

TCID50可用Reed-Muench法、內(nèi)插法、或Karber法計(jì)算。本試驗(yàn)用Reed-Muench法。取長滿單層細(xì)胞的96孔板，倒掉培養(yǎng)液，分別接種不同稀釋度的病毒，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔20μl，吸附1h后每孔加入維持液20μl，CO2條件下培養(yǎng)逐日觀察，記錄。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)病毒液稀釋

細(xì)胞管數(shù)累計(jì)細(xì)胞管數(shù)細(xì)胞管總數(shù)出現(xiàn)CPE空%

有

CPE

無

CPE

有CPE

無CPE10-1802702710010-2801901910010-3711111291.610-43546104010-517113140.710-608021210病毒（NDV）在CPE上滴定其TCID50動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)＝

高于50%的百分?jǐn)?shù)-50高于50%的百分?jǐn)?shù)-低于50%的百分?jǐn)?shù)91.6-5091.6-40＝41.651.6＝0.8

將此值加在高于50%死亡率的稀釋度的對數(shù)上。因此被測病毒的TCID50應(yīng)是將病毒作10-3.8，查反對數(shù)，得6310,即是將病毒液作6310倍稀釋，稀釋后每20μl含有一個(gè)TCID50。由表可以看出該病毒株的TCID50在91.6%與40%之間，其確切的稀釋倍數(shù)可按公式計(jì)算：動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)六、病毒囊膜的檢查

病毒的類脂主要存在于病毒的囊膜中，如果類脂溶解，囊膜即被破壞，致使病毒的感染力下降。病毒懸液用脂溶劑處理后如感染力有明顯下降即證明病毒有囊膜，最常使用的脂溶劑有乙醚、氯仿、去氧膽酸鈉，其中氯仿的效果最穩(wěn)定。步驟：1、氯仿法：病毒液20份﹢氯仿1份混均4℃感作10min，2000轉(zhuǎn)/分離心取上清待檢。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)2、乙醚法：病毒液4份﹢乙醚1份混均4℃過夜，2000轉(zhuǎn)/分離心取下層待檢。3、去氧膽酸酸鈉：用0.75%牛白蛋白配置0.2%去氧膽酸鈉，保存于4℃，用前放37℃，病毒液在做實(shí)驗(yàn)前用5000轉(zhuǎn)/分離心1h。將病毒上清與去氧膽酸鈉等量混合37℃1h，放透析袋中用PB透析24h，每4h換液一次，目的是除去去氧膽酸鈉對細(xì)胞的毒性作用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)4、將取出的液體作10倍遞進(jìn)稀釋滴定TCID50。5、每種方法均設(shè)對照。6、判定只要較對照組低2個(gè)滴度即證明敏感。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)七、病毒理化特性測定1、取病毒懸液2ml于試管中50℃水浴30min,2、取同樣病毒液4℃30min作對照，3、2組病毒懸液分別用維持液作10倍稀釋，4、用適宜的細(xì)胞測定其TCID50，較對照組低2個(gè)滴度即判為敏感。一、熱滅活實(shí)驗(yàn)，首先提出作用溫度。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

高濃度的二價(jià)陽離子MgCl2能使某些病毒在50℃穩(wěn)定，不被滅活，但對某些病毒MgCl2沒有保護(hù)作用，有時(shí)甚至增加對熱的敏感性。步驟：1、病毒懸液1ml﹢1mol/LMgCl29ml搖勻，2、病毒懸液1ml﹢維持液9ml搖勻，3、放50℃水浴1h后，將2組病毒液分別進(jìn)行連續(xù)10稀釋，測定TCID50。

二、陽離子穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)PH3或5經(jīng)30min作用后，有些病毒遭受損傷而使感染力降低，但有些病毒不受影響。1、病毒液1份﹢PH3或5Hank,s9份混均，2、病毒液1份﹢PH7.2Hank,s9份混均；3、在25℃水浴中感作30min；4、用0.1mol/LNaoH將實(shí)驗(yàn)組PH值調(diào)至7.2；5、2組分別作連續(xù)10倍稀釋測定TCID50。6、實(shí)驗(yàn)組較對照組低2個(gè)滴度為敏感。三、酸敏感試驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)實(shí)驗(yàn)八、病毒中和試驗(yàn)

本試驗(yàn)極為特異、敏感，是病毒學(xué)中重要的血清學(xué)試驗(yàn)。主要用于①病毒感染的血清學(xué)診斷；②病毒分離株的鑒定；③不同病毒株的抗原關(guān)系研究；④疫苗免疫原性的評價(jià)；⑤免疫血清的質(zhì)量評價(jià)；⑥測定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中是否存在抗體等。中和試驗(yàn)的步驟因病毒不同而變化，基本方法是病毒與血清混合，孵化后接種易感動(dòng)物、雞胚、細(xì)胞，以測定血清對病毒感染力的中和程度。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)1、稀釋液：乳漢液、Hank,s液、維持液。2、病毒制劑：從感染動(dòng)物分離的病毒必須在雞胚、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞中連續(xù)通過幾代，使其滴度穩(wěn)定后，才能用于本試驗(yàn)。感染力不應(yīng)太低。3、血清：在許多病毒感染的診斷中，常在患病急性期和康復(fù)期分別采血液，用已知病毒測定血清中和抗體的滴度。抗體滴度增高4倍以上，可認(rèn)為疾病由該病毒引起。一、準(zhǔn)備工作動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

血清使用前56℃滅活30min消除非特異性抑制物。4、病毒、血清混合液的處理：病毒與血清混合通常要37℃感作，使抗體與病毒充分混合?？筛鶕?jù)病毒的特性采用更為適宜的處理方法。有的病毒與血清混合不經(jīng)培養(yǎng)，立即進(jìn)行試驗(yàn)，效果也很好；有的病毒和血清混合37℃6h再4℃過夜，此法為免疫滅活，能檢出低水平的抗體。但大部分要37℃感作1h。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)5、實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：病毒與血清混合經(jīng)培養(yǎng)后按病毒特征接種到易感的系統(tǒng)中，以檢測混合液中未被中和的病毒的感染力。實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：⑴雞胚：此系統(tǒng)中血清的中和作用測定主要根據(jù)能否阻止雞胚死亡、絨尿膜上的豆癍形成、病毒的血凝。⑵實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：常用小鼠，觀察死亡率、發(fā)病率。⑶細(xì)胞：大多數(shù)在聚苯乙烯微量細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行微量中和試驗(yàn)。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測定方法不同，中和試驗(yàn)可分為終點(diǎn)法、蝕斑減數(shù)法、交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)、動(dòng)態(tài)法等4種類型。本試驗(yàn)以終點(diǎn)法中和試驗(yàn)為例：這是檢查血清內(nèi)中和抗體的最常用方法。具體方法有兩種，即固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法，其中以前一種方法更為常用。動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

在此實(shí)驗(yàn)中病毒量不變而將血清作倍比連續(xù)稀釋。此法常用于測定抗血清的滴度或疫苗的免疫原性。以新城疫為例在成纖維細(xì)胞上作中和試驗(yàn)。1、病毒：在細(xì)胞上滴定TCID50，用稀釋液稀釋病毒成200TCID50/20μl。2、血清：待檢血清和對照陰性血清滅活后按下表稀釋。二、正式實(shí)驗(yàn)㈠固定病毒稀釋血清中和試驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)待檢血清及陰性血清的稀釋

試管號(hào)12345678910稀釋液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5血清量（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5稀釋倍數(shù)2

481632641282565121024↘動(dòng)物病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)3、病毒-血清混合液：將病毒液0.5ml（200TCID50/20μl）與不同的待檢血清和陰性血清0.5ml分別混合，在37℃水浴中作用1h。4、接種細(xì)胞培養(yǎng)：將