磁變性淀粉微球固定化酶技術(shù)

磁變性淀粉微球固定化酶技術(shù)1所謂酶的固定化是指利用化學(xué)或物理手段將游離的酶定位于限定的空間區(qū)域并使其保持活性和可反復(fù)使用的一種基本技術(shù)。在理論及實(shí)際應(yīng)用上，酶固定化技術(shù)克服了游離酶的許多缺點(diǎn)，但是固定化酶技術(shù)目前還存在固定效率低、載體的有毒性、成本高、穩(wěn)定性差、不能大規(guī)模生產(chǎn)等問題，這些都限制了固定化酶技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用。在固定化酶技術(shù)中，載體材料的結(jié)構(gòu)和性能對(duì)酶的活性保持及應(yīng)用至關(guān)重要，因此對(duì)固定化酶載體的研究成為該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。磁性微球固定化酶就是利用磁性微體作為載體進(jìn)行酶的固定化，由于其具有環(huán)保、酶重復(fù)利用效果好和降低生產(chǎn)成本等優(yōu)點(diǎn)，近幾年已經(jīng)成為研究的焦點(diǎn)。2磁性淀粉微球是一類性能優(yōu)良的磁變性淀粉，它以淀粉類物質(zhì)為載體，包埋金屬或金屬氧化物，或者在磁流體上共價(jià)吸附或聚合淀粉類物質(zhì)形成的具有磁性的功能高分子材料，一般由磁核和淀粉分子層構(gòu)成。目前在固定化酶中使用磁核以Fe3O4最為常見。當(dāng)磁性粒子晶體直徑小于30nm時(shí)，則具有超順磁性。磁性淀粉微球的直徑一般在微米級(jí)或納米級(jí)，因此其具有超順磁性，在外加磁場(chǎng)的作用下快速分離，容易被磁力控制、定向、定位移動(dòng)和測(cè)定，此外，還具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和功能基特性等納米材料微粒子的特性，通過(guò)磁性淀粉微球表面的高分子殼層，可在其表面可引入一些功能基團(tuán)(如-OH，-COOH，-NH2等)，通過(guò)這些基團(tuán)可將酶修飾于磁性微粒表面。3作為一種新的固定化酶載體材料，用磁性變性淀粉微球作為固定化酶的載體具有無(wú)毒、材料來(lái)源廣、制備方便、成本較低、操作簡(jiǎn)便、可生物降解、從反應(yīng)體系中易分離和回收、利用外部磁場(chǎng)可以控制磁變性淀粉材料同定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向，替代傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方式，提高固定化酶的催化效率等諸多優(yōu)點(diǎn)，而且還具有良好的生物相容性，因此其在固定化酶領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。41.磁變性淀粉微球的制備根據(jù)不同的應(yīng)用方式，磁變性淀粉微球有三種結(jié)構(gòu)形式，即由金屬或金屬氧化物組成核，淀粉分子材料組成殼層；或者將淀粉材料作為核，磁性材料作為殼層；除此之外，也可以做成夾心結(jié)構(gòu)，即外層、內(nèi)層為淀粉分子材料，中間層為磁性材料。其中第一種研究得最多。高分子磁性微球的制備方法有很多，目前核殼式結(jié)構(gòu)的磁性微球的制備方法主要有包埋法、單體聚合法、共沉淀法、原位法等。51.1包埋法：包埋法是運(yùn)用機(jī)械攪拌、超聲分散等方法使磁性粒子均勻分散于淀粉溶液中，通過(guò)霧化、絮凝、沉淀、蒸發(fā)等手段使淀粉材料包埋磁性粒子。磁性粒子表面與親水性淀粉分子之間存在一定的親和力，所以若把磁性粒子浸泡于這些親水分子的溶液中，再經(jīng)過(guò)乳化等處理過(guò)程，就可以在磁性粒子表面形成淀粉分子殼層。為了增加微球的穩(wěn)定性，可用交聯(lián)劑交聯(lián)高分子殼層等進(jìn)行穩(wěn)定化處理。利用包埋法制備的磁性微球，方法簡(jiǎn)單，但得到的粒子粒徑分布寬，微球形貌不易控制。另外，微球中常含有乳化劑、沉淀劑等雜質(zhì)，因而在免疫診斷等領(lǐng)域會(huì)受到很大的限制。同時(shí)由于磁性材料一般為親水性顆粒，所以包埋的高分子一般也要為親水性分子，否則很難將磁性微粒完全包裹。這在一定程度上進(jìn)一步限制了包埋法的應(yīng)用。61.2體聚合法：?jiǎn)误w聚合法是在磁性粒子和單體存在下，加入引發(fā)劑、穩(wěn)定劑等進(jìn)行聚合反應(yīng)，得到內(nèi)部包有磁性微粒的高分子微球，主要有懸浮聚合、分散聚合、乳液聚合、輻射聚合等單體聚合方法。單體聚合法的優(yōu)點(diǎn)在于可以確保單體的聚合反應(yīng)在磁性粒子表面順利進(jìn)行。由于磁性粒子是親水性的，所以親水性單體(如淀粉)容易在磁性粒子表面進(jìn)行聚合，而對(duì)于親油性單體(如苯乙烯等)聚合反應(yīng)難以在磁性微粒表面進(jìn)行，因此要對(duì)磁性微粒進(jìn)行預(yù)處理或適當(dāng)改變有機(jī)體的組成。單體聚合法制備的磁性微球粒徑較大，且固載量小。目前研究較多的是乳液聚合法和分散聚合法。Noguchi等用乳液聚合法制備了磁性高分子微球。邱廣明等報(bào)道了磁性聚苯乙烯微球的合成，得到了穩(wěn)定性好、單分散的磁性微球。71.3共沉淀法：共沉淀法是金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應(yīng)生成磁性高分子微球的方法：2Fe3++Fe2++8OH-→Fe3O4+4H2O。共沉淀法制備方法簡(jiǎn)單，制得的磁性微球粒徑小，比表面積大，但只適用于表面含有特定功能基團(tuán)的聚合物，且由于磁性無(wú)機(jī)粒子在聚合物微球的表面發(fā)生沉積，所以最終制備出變性淀粉或多糖復(fù)合微球的表面不光滑，大小不均勻，磁響應(yīng)性較差，同時(shí)也限制了磁性復(fù)合微球的應(yīng)用。81.4原位合成法：原位合成法是淀粉分子材料分子鏈上具有極性基團(tuán)OH、-COOH等，在無(wú)氧條件下吸附二價(jià)鐵離子(Fe2+)，然后滴入雙氧水可把二價(jià)鐵離子(Fe2+)氧化成Fe2O3或Fe3O4磁性粒子，從而制備得變性淀粉磁性微球。原位法合成的淀粉磁性微球的粒徑和粒徑分布取決于聚合物微球本身，因此磁性淀粉或多糖微球具有良好的單分散性，各微球的磁含量相同，在磁場(chǎng)下具有一致的磁響應(yīng)性。VVeiga等利用原位聚合法制得超順磁環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)淀粉粒子，并對(duì)其Fe含量、磁力及顆粒形貌進(jìn)行了表征；Ugelstand等用原位法制備出了磁變性淀粉微球，并開發(fā)了系列商品化的產(chǎn)品Dynabeads。該產(chǎn)品已成功應(yīng)用于微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等諸多領(lǐng)域。92.磁變性淀粉微球固定化酶?jìng)鹘y(tǒng)的固定化酶的載體有硅、活性炭、多孔玻璃球、硅藻土和離子交換樹脂等，但由于這些載體反應(yīng)界面小、傳質(zhì)阻力大等因素，固定化酶的應(yīng)用效果受到一定限制。變性淀粉磁性微球作為酶的載體在功能基特性、表面效應(yīng)和體積效應(yīng)、機(jī)械剛性和穩(wěn)定性、重復(fù)使用性、磁響應(yīng)性等方面都具有很多優(yōu)點(diǎn)。磁性微球固定化酶是將游離酶的催化活動(dòng)完全或基本上限制在一定空間范圍內(nèi)的過(guò)程，基本原理為：將該磁性微球直接放入含有一定量酶的混合溶液中，使酶與微球表面活性基團(tuán)充分交聯(lián)。固定化反應(yīng)結(jié)束后，利用外部磁場(chǎng)對(duì)其進(jìn)行分離，然后再進(jìn)行純化，其方法可分為吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)偶合法、埋法等。102.1吸附法：通過(guò)氫鍵、電子親和力等把酶固定在變性淀粉磁性微球表面的方法稱為物理吸附法。該法條件溫和，酶的構(gòu)象變化較小或基本不變，因此對(duì)酶的催化活性影響小。但酶以離子鍵、氫鍵、偶極鍵及疏水健吸附在載體上，和載體之間結(jié)合力弱，在不適pH、高鹽濃度、高溫等條件下，酶易從載體脫落并污染催化反應(yīng)產(chǎn)物等。112.2交聯(lián)法：交聯(lián)法是用雙官能團(tuán)試劑或多官能團(tuán)試劑與游離酶的氨基酸殘基交聯(lián)，使酶分子和官能團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，制得三向的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外，還存在一定的分子內(nèi)交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑有戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2，2-二磺酸和環(huán)氧氯丙烷等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，戊二醛分子內(nèi)的醛基可與酶蛋白的游離氨基反應(yīng)，形成席夫堿而使酶分子交聯(lián)。用交聯(lián)法制備的固定化酶結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用。但是交聯(lián)反應(yīng)較激烈，酶活可能損失較大。實(shí)際上交聯(lián)法往往與其他固定化方法聯(lián)合使用作為其它固定化方法的輔助手段，這種采用兩種或多種方法進(jìn)行固定化的技術(shù)，稱為雙重或多重固定化法，用此法制備的固定化酶活性高，機(jī)械強(qiáng)度好。122.3共價(jià)偶合法：共價(jià)結(jié)合法是利用酶蛋白分子上的非必需基團(tuán)與載體反應(yīng)，形成共價(jià)結(jié)合的固定化酶的方法稱為共價(jià)結(jié)合法。這時(shí)酶與載體結(jié)合非常牢固，不易發(fā)生酶的脫落，有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，有利于保持酶的活性．而且磁響應(yīng)性也較強(qiáng)，但載體的活化操作比較復(fù)雜。2.4包埋法：包埋法是酶在載體中發(fā)生聚合、沉淀，并被物理包埋于高聚物網(wǎng)格內(nèi)的方法，一般反應(yīng)條件溫和，對(duì)酶自身的結(jié)構(gòu)改變很少，因此酶活性損失較小，固定化效率較高。得到的磁性固定化酶很容易從反應(yīng)混合物中回收，并且沒有酶的活性損失。133.各種磁性微球固定化酶的應(yīng)用由于磁性微球具有高分子微粒子的特性，可以對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾從而賦予其表面多種具有與生物活性物質(zhì)反應(yīng)的特殊功能基團(tuán)，酶分子可通過(guò)物理吸附、交聯(lián)、共價(jià)偶合等方式固定在磁性淀粉微球表面。磁性微球固定化酶有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)有利于固定化酶的分離和回收，操作簡(jiǎn)單、易行；(2)對(duì)于雙酶反應(yīng)體系，當(dāng)一種酶的失活較快時(shí)，用磁性材料來(lái)固載另一種酶，回收

后可反復(fù)使用，降低成本；(3)利用外部磁場(chǎng)控制固定化酶的運(yùn)動(dòng)方式和方向，提高酶的催化效率；(4)改善酶的生物相容性、免疫活性、親疏水性、提高酶的穩(wěn)定性。143.1磁性微球固定化酶在化工生產(chǎn)上的應(yīng)用：磁性微球固定化酶可催化多種化學(xué)反應(yīng)，在化工過(guò)程中具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，可以提高對(duì)應(yīng)選擇性及重復(fù)利用率。例如，Bai等以超順磁性顆粒Fe3O4作為載體，經(jīng)碳二亞胺活化共價(jià)結(jié)合脂肪酶CRL，并研究此固定化脂肪酶催化酯化拆分外消旋薄荷醇的反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)固定化脂肪酶具有較高的對(duì)映選擇性和良好的重復(fù)利用性。并且在皮革的生產(chǎn)過(guò)程中采用磁性固定化酶技術(shù)，在酶處理達(dá)到預(yù)期目的之后，可以將其中的酶完全回收，這樣不僅提高了經(jīng)濟(jì)效益，而且有利于皮革產(chǎn)品質(zhì)量的控制。153.2磁性微球固定化酶在食品工業(yè)上的應(yīng)用由于固定化酶具有較好的穩(wěn)定性，磁性微球固定化酶技術(shù)在食品、發(fā)酵工業(yè)、淀粉糖工業(yè)和乳制品工業(yè)方面具有好的應(yīng)用前景。例如，Qiu等采用粒徑為0.08-0.8μm的Fe3O4/P(St-MA)微球?yàn)檩d體，用共價(jià)偶聯(lián)法固定α-淀粉酶，并用其催化淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，研究結(jié)果表明，固定化淀粉酶的總活力達(dá)113800U，最高固載量為44.3mg/g，活性回收率為47.2%，與游離酶相比該固定化酶具有較高的穩(wěn)定性。3.3磁性微球固定化酶在環(huán)保方面上的應(yīng)用：隨環(huán)境污染的日趨嚴(yán)重及其治理的日益迫切，磁性微球固定化酶在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域也將具有重要用途。Arica等對(duì)Fe3O4/P(MMA)微球固定化葡萄糖淀粉酶處理淀粉廢水和造紙廢水的催化處理效果進(jìn)行了研究，探討了反應(yīng)時(shí)間和酶活力對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示固定化酶處理廢水具有較大的優(yōu)越性。164.前景展望用磁性微球作為固定化酶載體是固定化載體材料發(fā)展的必然趨勢(shì)。作為一種新型載體，磁性高分子微球具有良好的應(yīng)用前景，它受到了各國(guó)學(xué)者的高度重視，得到了廣泛的研究。由于目前應(yīng)用于固定化酶載體的材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，如天然高分子材料作為載體材料時(shí)具有無(wú)毒性、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點(diǎn)，但材料強(qiáng)度較低；合成有機(jī)高分子材料在作為載體材料時(shí)具有很強(qiáng)的靈活性，但傳質(zhì)性能較差；無(wú)機(jī)材料穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度高、成本低，但用于固定化酶時(shí)，固定化率均比較低。與這些固定化材料相比，磁性微球具有在分離上的巨大優(yōu)勢(shì)，易回收、操作簡(jiǎn)便、成本較低，從經(jīng)濟(jì)效益方面來(lái)講，磁性微球載體是工業(yè)化生產(chǎn)的最優(yōu)選擇。17但是，對(duì)于磁性微球固定化酶的研究，