熒光定量PCR技術(shù)與常見問題分析

熒光定量PCR技術(shù)與常見問題分析定量PCR是如何工作的第2頁,共108頁，2024年2月25日，星期天熒光定量PCR是什么一種實時監(jiān)控目的基因PCR擴增的技術(shù)第3頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR是如何工作的?傳統(tǒng)PCR

具有以下基本要素dsDNA模版,primers引物,dNTPs核苷酸,PCRbuffer緩沖液,TaqpolymeraseDNA聚合酶等TGCAAACAGATTAGACATAGATAGACAGATTAGATAGACTTAGATGTTTGGCAACGTTTGTCTAATCTGTATCTATCTGTCTAATCTATCTGAATCTACAAACCGTMg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+Mg2+TACGGAGCTGA第4頁,共108頁，2024年2月25日，星期天與傳統(tǒng)PCR一樣,反應(yīng)在溫度模塊里循環(huán)進行:>雙鏈DNA模板變性>引物與模板退火>引物延伸

新的擴增片段定量PCR是如何工作的?理論上每經(jīng)過一個循環(huán)目的基因的數(shù)量都會增加一倍第5頁,共108頁，2024年2月25日，星期天在PCR混合液中含有熒光物質(zhì)。定量PCR是如何工作的?第6頁,共108頁，2024年2月25日，星期天無論哪個型號，所有的熒光定量PCR儀都有三個共同的組成部分定量PCR是如何工作的?第7頁,共108頁，2024年2月25日，星期天PCRPCRLotsofPCRPCRproduct隨著擴增的進行,熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加定量PCR是如何工作的?第8頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Real-timePCR儀會記錄每個循環(huán)經(jīng)過每個濾光片的熒光信號變化定量PCR是如何工作的?Cycle1FilterASample1Level:第9頁,共108頁，2024年2月25日，星期天為什么要用定量PCR？

重復(fù)性好

靈敏度高

動力學范圍寬一個好的定量PCR數(shù)據(jù)第10頁,共108頁，2024年2月25日，星期天1:重復(fù)性好第11頁,共108頁，2024年2月25日，星期天2:靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因第12頁,共108頁，2024年2月25日，星期天3:動態(tài)范圍寬兼具重復(fù)性和準確性的起始模版濃度范圍(越大越好)第13頁,共108頁，2024年2月25日，星期天為什么要用定量PCR？

快：節(jié)省時間和勞力（不用電泳檢測）。第14頁,共108頁，2024年2月25日，星期天為什么要用定量PCR？

安全：不用EB或放射性物質(zhì)第15頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR的化學原理第16頁,共108頁，2024年2月25日，星期天支持的化學試劑SYBR?GreenITaqMan?第17頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?

中會使用到兩段短片段序列，稱為雙向特異引物TaqMan?

化學原理

第18頁,共108頁，2024年2月25日，星期天第三段短片段序列，又稱為探針,位于序列中間TaqMan?

化學原理

第19頁,共108頁，2024年2月25日，星期天報告染料Reporterdye淬滅染料Quencherdye探針標記兩種

染料分子TaqMan?

化學原理

第20頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Reporter沒有熒光信號（發(fā)射）能量光(激發(fā))完整的探針TaqMan?

化學原理

第21頁,共108頁，2024年2月25日，星期天光能然而，如果探針斷裂了……TaqMan?

化學原理

第22頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Denaturation變性(95oC)TaqMan?

化學原理

第23頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Annealing退火(60oC)TaqMan?

化學原理

第24頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶登場……TaqMan?

化學原理

第25頁,共108頁，2024年2月25日，星期天找到引物序列……TaqMan?

化學原理

第26頁,共108頁，2024年2月25日，星期天開始延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

第27頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

第28頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

第29頁,共108頁，2024年2月25日，星期天?Extension延伸(60oC)TaqMan?

化學原理

第30頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶很特別……具有核酸外切酶活性，可以‘吃掉’結(jié)合到模板上的DNA片段TaqMan?

化學原理

第31頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第32頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第33頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第34頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第35頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第36頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第37頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第38頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第39頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第40頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第41頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第42頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第43頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第44頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第45頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Taq酶降解探針TaqMan?

化學原理

第46頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?

化學原理

第47頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?

化學原理

第48頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?

化學原理

第49頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?

化學原理

第50頁,共108頁，2024年2月25日，星期天嗝!TaqMan?

化學原理

第51頁,共108頁，2024年2月25日，星期天SYBR?GreenI化學原理第52頁,共108頁，2024年2月25日，星期天SYBR?GreenI染料第53頁,共108頁，2024年2月25日，星期天SYBR?GreenI染料第54頁,共108頁，2024年2月25日，星期天SYBR?GreenI染料第55頁,共108頁，2024年2月25日，星期天SYBR?GreenI染料的缺點非特異結(jié)合任意

雙鏈DNA定量結(jié)果不準確非特異性PCR產(chǎn)物信號第56頁,共108頁，2024年2月25日，星期天使用熔解曲線Meltcurve(DissociationCurve)檢查反應(yīng)特異性Temperature

Fluorescence第57頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Meltcurve:

導(dǎo)數(shù)圖譜一個干凈的峰=沒有無關(guān)的產(chǎn)物Temperature

Fluorescence第58頁,共108頁，2024年2月25日，星期天Meltcurve的雜峰可能是引物二聚體第59頁,共108頁，2024年2月25日，星期天多余的峰是如何產(chǎn)生的?非特異擴增1、轉(zhuǎn)錄組中錯誤的目的基因。2、引物結(jié)合在正確的序列,但是既檢測基因組DNA又檢測cDNA(由于短的內(nèi)含子,基因組DNA有較高的Tm值)。解決方法：設(shè)計引物時至少有一條跨過外顯子的結(jié)合點

引物二聚體第60頁,共108頁，2024年2月25日，星期天到底用哪一種化學方法呢？TaqMan?,還是SYBR?Green?...第61頁,共108頁，2024年2月25日，星期天TaqMan?,還是...

SYBR?GreenI?優(yōu)點更高的特異性

不會有引物二聚體干擾支持多重熒光實驗設(shè)計實驗方法易于優(yōu)化缺點價格稍貴優(yōu)點價格便宜大部分基因以及少量樣品均適用缺點特異性稍差必須要做Meltcurves不支持多重熒光設(shè)計實驗方法通常需要優(yōu)化第62頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR的數(shù)學原理第63頁,共108頁，2024年2月25日，星期天怎樣獲得結(jié)果首先讓我們定義擴增曲線的各種參數(shù)。第64頁,共108頁，2024年2月25日，星期天PCR的動力學曲線和四個階段第65頁,共108頁，2024年2月25日，星期天指數(shù)擴增期重復(fù)性準確性動態(tài)范圍3個階段中最佳時期第66頁,共108頁，2024年2月25日，星期天只有一個擴增期提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù)指數(shù)擴增期第67頁,共108頁，2024年2月25日，星期天基線基線（空白）信號的產(chǎn)生是由于背景引起的第68頁,共108頁，2024年2月25日，星期天閾值默認閾值=基線（背景）信號標準偏差x10第69頁,共108頁，2024年2月25日，星期天怎么獲得結(jié)果第一步：確定Ct值第70頁,共108頁，2024年2月25日，星期天怎么獲得結(jié)果第二步：比較Ct值第71頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR的應(yīng)用絕對定量相對定量陰陽性鑒定基因分型第72頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR實驗設(shè)計和流程

---絕對定量和相對定量第73頁,共108頁，2024年2月25日，星期天定量PCR的實驗要素

目的基因樣品標準曲線標準品監(jiān)控系統(tǒng)故障陽性對照監(jiān)控污染陰性對照校準生物學誤差內(nèi)參(管家基因)校準物理誤差參比熒光降低隨機誤差重復(fù)實驗第74頁,共108頁，2024年2月25日，星期天相對定量實驗示例實驗未處理樣本處理后樣本目的基因：Plat1實驗?zāi)康模簶颖咎幚砗?，Plat1基因的表達量有什么變化？第75頁,共108頁，2024年2月25日，星期天實驗流程對照樣本第76頁,共108頁，2024年2月25日，星期天兩種相對定量的方法比較Ct（ΔΔCt）法相對標準曲線法樣本間目的基因的倍數(shù)關(guān)系第77頁,共108頁，2024年2月25日，星期天兩種方法的區(qū)別

比較Ct(ΔΔCt)法

相對標準曲線法*已知各個基因的擴增效率*每個基因都要做一條標準曲線*不需要每次都做標準曲線*準確的擴增效率計算*簡單,經(jīng)濟,通量較高*工作量大,成本高,通量較低第78頁,共108頁，2024年2月25日，星期天如何選擇相對定量的方法第79頁,共108頁，2024年2月25日，星期天如何選擇相對定量的方法第80頁,共108頁，2024年2月25日，星期天如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表第81頁,共108頁，2024年2月25日，星期天如何選擇相對定量的方法在EXCEL中制作圖表斜率<0.1斜率>0.1比較Ct(ΔΔCt)法相對標準曲線法第82頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法必要條件：目的基因和內(nèi)參基因必須有相一致的擴增效率，并盡可能接近100%。第83頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法如何確認擴增效率接近100%？每條引物一條標準曲線第84頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法標準曲線可以幫助判定擴增效率例如：斜率-3.3說明擴增效率接近100%；更小的負值（如-3.5）說明擴增效率小于100%公式：E=10(-1/斜率)-1第85頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法結(jié)果計算步驟一：內(nèi)參基因均一化樣本差異Ct目的基因-Ct目的基因=

ΔCt步驟二：處理樣本和對照樣本作比較

ΔCt處理樣本-ΔCt對照樣本=

ΔΔCt步驟三：使用公式計算

倍數(shù)變化

=2

-ΔΔCt第86頁,共108頁，2024年2月25日，星期天公式含義2

-ΔΔCt2=循環(huán)間擴增產(chǎn)物量的變化（PCR擴增產(chǎn)物倍增）ΔΔCt=處理樣本和對照樣本之間校正過大循環(huán)數(shù)的變化所以，這個公式告訴我們對照樣本和處理樣本之間目的基因的倍數(shù)變化。第87頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法計算示例第88頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法計算示例為了去除樣本間加樣量不同帶來的誤差，需要對數(shù)據(jù)均一化處理。第89頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法計算示例首先，選擇對照樣本；接著，均一化對照樣本；然后，所有樣本和對照樣本進行比較。第90頁,共108頁，2024年2月25日，星期天ΔΔCt法計算示例最后，計算出倍數(shù)關(guān)系2

–ΔΔCt。第91頁,共108頁，2024年2月25日，星期天相對標準曲線法每對引物做一條相對標準曲線第92頁,共108頁，2024年2月25日，星期天相對標準曲線法計算示例表示倍數(shù)差異第93頁,共108頁，2024年2月25日，星期天絕對定量實驗

目的：生成標準曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系；

要求：

濃度已知

標準品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100%

–儀器質(zhì)量一致

–試劑質(zhì)量一致：模板純度、引物和探針的Tm值、酶活性、緩

沖液成分

–反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)相同、同一次實驗標準品的準備第94頁,共108頁，2024年2月25日，星期天絕對定量實驗Don’t:?制備3個點的2倍標準曲線要求：Do:?制備至少5個點的標準曲線(4logs)?去除離散的重復(fù)孔，或者有必要時去除整個梯度數(shù)據(jù)如何制備標準曲線第95頁,共108頁，2024年2月25日，星期天絕對定量實驗

選擇目標→提取/PCR→純化→測定濃度→調(diào)整濃度→梯度稀釋Ct值在17-30之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標準品i)+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v注：不可由標準品i分別加不同體積的稀釋緩沖液直接得到標準品ii、iii、iv、v標準品梯度稀釋方法第96頁,共108頁，2024年2月25日，星期天絕對定量實驗擴增效率：每個循環(huán)中靶分子被作為模板利用的百分比。PCR效率的測定第97頁,共108頁，2024年2月25日，星期天常見問題分析第98頁,共108頁，2024年2月25日，星期天1.擴增效率為什么達不到100%主要原因：樣品不純擴增產(chǎn)物太長沒有選擇合適的引物退火溫度引物的設(shè)計有錯配模板的序列特殊（比如GC含量高）抑制物的存在第99頁,共108頁，2024年2月25日，星期天2.擴增效率為什么會大于100%主要原因：背景污染非特異性擴增第100頁,共108頁，2024年2月25日，星期天3.實驗結(jié)果的重復(fù)性不好對每個樣品我們都要做重復(fù)實驗（通常至少為3個重復(fù)）目標是所有復(fù)孔CT