生物化學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)-DNA瓊脂糖凝膠電泳

生物化學(xué)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)——DNA瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆操作。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度離心法）所無(wú)法分離的DNA片段。影響DNA遷移率的因素影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成等緩沖液pH>DNApI，DNA帶負(fù)電荷，遷移率與分子量對(duì)數(shù)成反比DNA分子構(gòu)象影響遷移率：共價(jià)閉環(huán)DNA>線狀DNA>開(kāi)環(huán)DNADNA片段越長(zhǎng)，泳動(dòng)速度越慢在低電壓時(shí)，泳動(dòng)速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比不同濃度瓊脂糖分離DNA分子的范圍瓊脂糖濃度（W/V,%）分離范圍（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。嵌入染料的存在

熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強(qiáng),還會(huì)使線狀DNA遷移率降低15％。離子強(qiáng)度影響

電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響DNA的電泳遷移率。在無(wú)離子存在時(shí)(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導(dǎo)率最小,DNA幾乎不移動(dòng);在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或DNA變性。瓊脂糖凝膠中DNA的觀察溴化乙錠（EB）—DNA：紫外光下桔紅色熒光主要實(shí)驗(yàn)器材電泳儀電泳槽緩沖液瓊脂糖凝膠槽梳子取液器溴酚藍(lán)電泳槽結(jié)構(gòu)緩沖溶液配制表電泳指示劑核酸電泳常用的指示劑有兩種:溴酚藍(lán)(bromophenolblue,Bb)呈藍(lán)紫色；二甲苯腈(xylene

cyanol,Xc

）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的遷移率比溴酚藍(lán)慢。

膠濃（%）溴酚藍(lán)二甲苯腈0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb操作步驟瓊脂糖凝膠的制備：溶化，冷卻，EB凝膠板的制備：加梳子，倒膠樣品的制備：樣品+1/5體積溴酚藍(lán)加樣：加樣端為負(fù)極（黑）電泳：5V/cm觀察：紫外燈下觀察，照相溶膠準(zhǔn)備膠槽凝膠冷卻至50°C，加EB至終濃度0.