微生物的生長規(guī)律

第二節(jié)微生物的生長規(guī)律一、微生物的個體生長和同步生長由于微生物細胞極其微小，研究其個體生長存在著技術(shù)上的困難。同步生長的概念：一個細胞群體中各個細胞都在同一時間進行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長（synchronousgrowth），進行同步分裂的細胞稱為同步細胞。同步細胞群體在任何一時刻都處在細胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料5/8/20241微生物的生長規(guī)律獲得同步生長的方法獲得同步生長的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過濾、梯度離心。物理方法，隨機選擇，不影響細胞代謝。5/8/20242微生物的生長規(guī)律Helmstetter-Cummings法原理：一些細菌細胞會緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過微孔濾膜，細胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過濾膜，洗掉浮游細胞；除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來的新生細胞，即為同步培養(yǎng)。5/8/20243微生物的生長規(guī)律Figure5.

Thesynchronousgrowthofabacterial

population.

Bycarefulselectionofcellsthathave

justdivided,abacterialpopulationcanbe

synchronizedinthebacterialcelldivisioncycle.

Synchronycanbemaintainedforonlyafewgenerations.

Figure.synchronousgrowth5/8/20244微生物的生長規(guī)律二、微生物的群體生長☆無分支單細胞微生物主要包括細菌和酵母菌，其群體生長是以群體中細胞數(shù)量的增加來表示的。☆由一個細胞分裂成為兩個細胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細胞數(shù)目擴大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間?！钣覉D表示的是一個細胞經(jīng)過若干代分裂后的情況。右圖可見，每經(jīng)過一個代時，細胞數(shù)目就增加一倍，呈指數(shù)增加，因而被稱為指數(shù)生長，這就是單細胞群體生長的特征。

1.無分支單細胞微生物的群體生長特征5/8/20245微生物的生長規(guī)律Bydefinition,bacterialgrowthiscellreplication–i.e.,growthoftheculture.Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission,whereonecelldividesinto2cells,the2cellsinto4,the4into8,etc.Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate–suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions–wecanplotnumbersofcellsvs.timesuchasonthegraphatright.Beforetoolong,wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble.Foraculturewherecellsdivideevery20minutes,onecellcanresultin16,777,216(i.e.,224)cellsafterjust8hours–barringnutrientdepletionorothergrowth-alteringconditions.1.無分支單細胞微生物的群體生長特征5/8/20246微生物的生長規(guī)律Ifweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale–asonthegraphatright–wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper,andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline.(Ontheverticalaxis,thesamedistanceonthepaperiscoveredwitheachdoubling.)Thistypeofgraphpaperiscalledsemilogarithmicgraphpaperonwhichwewillbeplottingourclassresults.Thenumbersweplotwillfallonthegraphatthesameplacethelogarithmsofthesenumberswouldfallwhenplottedonconventionalgraphpaper.5/8/20247微生物的生長規(guī)律Theexampleatrightshowsthetypeofgraphwemayobtainfromourclassdata.Wecanplotbothcolony-formingunits(CFUs)permlandabsorbanceonthesamegraph,rememberingthattheabsorbanceunitsshouldalsobeonalogarithmicscale.Ratherthan"connectingthedots,"wedrawthebeststraightlineamongourCFU/mlplotstorepresentthephasesofgrowth–lag,exponential,andthestartofthemaximumstationaryphase.5/8/20248微生物的生長規(guī)律指數(shù)生長可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由試驗獲得，n可通過上式計算得出，將等式兩側(cè)取對數(shù)重排后得：lgb=lgB+nlg2lgb-lgBlgb-lgB

lg20.301式中：B為起始師細胞數(shù)目，

b為指數(shù)生長某個時刻t時的細胞數(shù)目，

n為世代數(shù)=指數(shù)生長n=5/8/20249微生物的生長規(guī)律例如：一培養(yǎng)液中微生物數(shù)目由開始的12，000（B），經(jīng)4h（t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，還可以計算出不同培養(yǎng)條件下的代時G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時為20分鐘。在4小時內(nèi)共繁殖了12代。5/8/202410微生物的生長規(guī)律★代時能夠反應(yīng)細菌的生長速率，代時短，生長速率快，代時長，生長速率慢。在很多微生物學(xué)研究中常常要了解微生物的代時?！锎鷷r在不同種微生物中的變化很大，多數(shù)微生物的代時為1~3h,然而有些快速生長的微生物的代時還不到10min,而另一些微生物的代時卻可長達幾小時或幾天；另外，同一種微生物，在不同的生長條件下其代時的長短也不同；但是，在一定條件下，每一種微生物的代時是恒定的，因此它是微生物菌種的一個重要特征。5/8/202411微生物的生長規(guī)律一些細菌的代時菌名培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度代時E.coli（大腸桿菌）肉湯37℃17minE.Coli牛奶3712.5Enterobacteraerogenes（產(chǎn)氣腸細菌）肉湯或牛奶3716~18E.aerogenes組合3729~44B.Cereus（蠟狀芽孢桿菌）肉湯3018B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌）肉湯5518.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌）牛奶3766~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌）牛奶3726S.lactis乳糖肉湯3748Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌）肉湯3723.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖25344~46Mycobacteriumtuberculosis（結(jié)核分枝桿菌）組合37792~93Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌）組合2712005/8/202412微生物的生長規(guī)律BacteriumMediumGenerationTime(minutes)EscherichiacoliGlucose-salts17Bacillus

megateriumSucrose-salts25Streptococcus

lactisMilk26StreptococcuslactisLactosebroth48StaphylococcusaureusHeartinfusionbroth27-30LactobacillusacidophilusMilk66-87Rhizobium

japonicumMannitol-salts-yeastextract344-461MycobacteriumtuberculosisSynthetic792-932TreponemapallidumRabbittestes1980Table.Generationtimesforsomecommonbacteriaunderoptimalconditionsofgrowth.

5/8/202413微生物的生長規(guī)律

不同溫度下的代時溫度對微生物的代時有明顯影響：E.Coli在不同溫度下的代時溫度（℃）代時（分）溫度（℃）代時（分）10860352215120371720904017.525404520302947.5775/8/202414微生物的生長規(guī)律G(generationtime)=t(time,inminutesorhours)/n(numberofgenerations)G=t/nG=generationtime(timeforthecellstodivide)t=timeintervalinhoursorminutesB=numberofbacteriaatthebeginningofatimeintervalb=numberofbacteriaattheendofthetimeintervaln=numberofgenerations(numberoftimesthecellpopulationdoublesduringthetimeinterval)b=Bx2n(Thisequationisanexpressionofgrowthbybinaryfission)G=t/nSolveforn:n=logB+nlog2n=logb-logB

log2n=logb-logB

.301n=3.3logb/BG=t/nSolveforGG=

t

3.3logb/BCalculationofGenerationTime5/8/202415微生物的生長規(guī)律Example:Whatisthegenerationtimeofabacterialpopulationthatincreasesfrom10,000cellsto10,000,000cellsinfourhoursofgrowth?

G=

t

3.3logb/BG=

240minutes

3.3log107/104

G=

240minutes

3.3x3G=24minutes

5/8/202416微生物的生長規(guī)律2.無分支單細胞微生物的群體生長曲線☆以細菌為例介紹無分支單細胞微生物群體生長規(guī)律，其結(jié)論也基本適用于酵母菌?！钌L曲線代表了細菌在新的環(huán)境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態(tài)變化過程。☆每種細菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規(guī)律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。5/8/202417微生物的生長規(guī)律將少量單細胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，測菌細胞數(shù)目。以培養(yǎng)時間為橫坐標，以細菌增長數(shù)目的對數(shù)為縱坐標，繪制所得的曲線。生長曲線的制作5/8/202418微生物的生長規(guī)律典型的生長曲線

（Growthcurve）延滯期對數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期時期的劃分：按照生長速率常數(shù)（growthraceconstant）不同5/8/202419微生物的生長規(guī)律一條典型的生長曲線至少可以分為遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期等四個生長時期。5/8/202420微生物的生長規(guī)律.

5/8/202421微生物的生長規(guī)律其它名稱：停滯期、調(diào)整期、適應(yīng)期1.現(xiàn)象：活菌數(shù)沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點：生長速率常數(shù)=0細胞形態(tài)變大或增長細胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3.原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物①延滯期（lagphase）5/8/202422微生物的生長規(guī)律◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡：用對數(shù)生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；◆培養(yǎng)基成分：

在營養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長時短；

接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。★影響延遲期長短的因素5/8/202423微生物的生長規(guī)律認識延遲期的特點及形成原因?qū)嵺`的指導(dǎo)意義◆在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優(yōu)勢----適應(yīng)性增強）②采用對數(shù)生長期的健壯菌種；③調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業(yè)上，盡量在此期進行消毒或滅菌5/8/202424微生物的生長規(guī)律②對數(shù)期（logarithmicphase）其他名稱：指數(shù)期現(xiàn)象：細胞數(shù)目以幾何級數(shù)增加，其對數(shù)與時間呈直線關(guān)系。

特點：生長速率常數(shù)最大，即代時最短細胞進行平衡生長，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致代謝最旺盛細胞對理化因素較敏感影響因素：菌種營養(yǎng)成分營養(yǎng)物濃度﹡培養(yǎng)溫度5/8/202425微生物的生長規(guī)律應(yīng)用意義①由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；②發(fā)酵工業(yè)上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度③食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進入此期④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。5/8/202426微生物的生長規(guī)律營養(yǎng)物濃度與對數(shù)期生長速率和產(chǎn)量作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長速率和菌體產(chǎn)量的營養(yǎng)物就稱生長限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長速度和最大收獲量受影響時間細胞數(shù)或菌體量5/8/202427微生物的生長規(guī)律③穩(wěn)定期（stationaryphase）又稱：恒定期或最高生長期特點：①新增殖的細胞數(shù)與老細胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長速率處于動態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細胞數(shù)目達到最高值。②細胞分裂速度下降，開始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細菌開始產(chǎn)芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產(chǎn)物，對于發(fā)酵生產(chǎn)來說，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。產(chǎn)生原因：

營養(yǎng)物尤其是生長限制因子的耗盡營養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適;有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適;5/8/202428微生物的生長規(guī)律應(yīng)用意義：1）發(fā)酵生產(chǎn)形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長此期，提高產(chǎn)量，措施如下：補充營養(yǎng)物質(zhì)（補料）調(diào)pH調(diào)整溫度2）穩(wěn)定期細胞數(shù)目及產(chǎn)物積累達到最高。生長產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長得率，growthyield）：概念：表示微生物對基質(zhì)利用效率的高低Y=菌體干重/消耗營養(yǎng)物質(zhì)的濃度

根據(jù)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養(yǎng)物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C05/8/202429微生物的生長規(guī)律④衰亡期（declinephase）特點①細胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過新增殖的細胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負生長”。②細胞內(nèi)顆粒更明顯，細胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等，發(fā)生自溶的菌生長曲線表現(xiàn)為向下跌落的趨勢。衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。產(chǎn)生原因生長條件的進一步惡化，使細胞內(nèi)的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡5/8/202430微生物的生長規(guī)律lg細胞數(shù)或產(chǎn)物濃度時間細胞產(chǎn)物I型 II型3.微生物生長與代謝產(chǎn)物形成的關(guān)系微生物發(fā)酵形成產(chǎn)物的過程與微生物細胞生長的過程并不總是一致的。一般認為：初級代謝是給予生物能量和生成中間產(chǎn)物的過程，初級代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細胞的形成過程同步，微生物生長的穩(wěn)定期是這些產(chǎn)物的最佳收獲時機；次級代謝產(chǎn)物與微生物的生存、生長和繁殖無關(guān)。次級代謝產(chǎn)物的形成往往與微生物細胞的形成過程不同步。在分批培養(yǎng)中，它們的形成高峰往往在微生物生長穩(wěn)定期的后期或衰亡期。5/8/202431微生物的生長規(guī)律4.絲狀微生物的群體生長絲狀微生物的純培養(yǎng)采用孢子接種，在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)或深層通氣加攪拌培養(yǎng)，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)?？梢杂镁z干重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線?？煞譃槿齻€階段：1、生長停滯期2、迅速生長期3、衰退期5/8/202432微生物的生長規(guī)律1、生長停滯期:造成生長停滯的原因一是孢子萌發(fā)前真正的停滯狀態(tài)，另一種是生長已經(jīng)開始，但還無法測定。2、迅速生長期:菌絲體干重迅速增加，其立方根與時間呈直線關(guān)系，菌絲干重不以幾何級數(shù)增加，沒有對數(shù)生長期。生長主要表現(xiàn)在菌絲尖端的伸長和出現(xiàn)分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產(chǎn)物。3、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。大多數(shù)次級代謝產(chǎn)物在此期合成，大多數(shù)細胞都出現(xiàn)大的空泡。有些菌絲體還會發(fā)生自溶菌絲體，這與菌種和培養(yǎng)條件有關(guān)。絲狀微生物的群體生長分期

5/8/202433微生物的生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）分批培養(yǎng)（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuousculture）：在微生物培養(yǎng)的過程中，不斷地供給新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，同時排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長時間地處于對數(shù)生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。連續(xù)培養(yǎng)理論基礎(chǔ)：由于對典型生長曲線中穩(wěn)定期到來原因的認識，采取相應(yīng)有效措施推遲其來臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。5/8/202434微生物的生長規(guī)律原理：當微生物在單批培養(yǎng)方式下生長達到對數(shù)期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達到動態(tài)平衡，其中的微生物就能長期保持對數(shù)期的平衡生長狀態(tài)和穩(wěn)定的生長速率。單批培養(yǎng)恒濁法恒化法單批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng) 時間連續(xù)流入新鮮培養(yǎng)液lg細胞數(shù)（個/ml）連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)原理5/8/202435微生物的生長規(guī)律按控制方式分按培養(yǎng)器的級數(shù)分按細胞狀態(tài)分

按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續(xù)培養(yǎng)器多級連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細胞連續(xù)培養(yǎng)器實驗室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器5/8/202436微生物的生長規(guī)律連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)——恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使營養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖。特點