肉制品中大腸菌群的檢驗(yàn)（肉制品檢測）

食品中大腸菌群檢驗(yàn)GB4789.3一2016的解讀GB4789.3一2016與2010版相比內(nèi)容的變化一GB4789.3一2016適用范圍和檢驗(yàn)原理二MPN計(jì)數(shù)法中所用的培養(yǎng)基的成分的用途說明三目錄

平板計(jì)數(shù)法中所用的培養(yǎng)基的成分的用途說明四一、GB4789.3一2016與2010版相比內(nèi)容的變化本標(biāo)準(zhǔn)與GB4789.3—2010相比,主要變化如下:

1.增加了檢驗(yàn)原理;2.修改了適用范圍;3.修改了典型菌落的形態(tài)描述;4.修改了第二法平板菌落數(shù)的選擇;5.修改了第二法證實(shí)試驗(yàn);6.修改了第二法平板計(jì)數(shù)的報(bào)告。食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀二、GB4789.3一2016適用范圍和檢驗(yàn)原理1.適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(Coliforms)計(jì)數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2.檢驗(yàn)原理2.1MPN法最可能數(shù)Mostprobablenumber；MPN基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀二、GB4789.3一2016適用范圍和檢驗(yàn)原理MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。MPN值只是樣品中活菌密度的估算值，并不是樣品中活菌菌落數(shù)的真值。MPN檢索表是國際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO、美國食品藥品管理局FDA、美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)AOAC、美國農(nóng)業(yè)部食品安全與監(jiān)測服務(wù)部USDA/FSIS和北歐等組織制定的標(biāo)準(zhǔn)所通用的。食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀二、GB4789.3一2016適用范圍和檢驗(yàn)原理2.2平板計(jì)數(shù)法大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。平板計(jì)數(shù)法相對于MPN法來說，檢驗(yàn)結(jié)果更精確。適合用于污染比較嚴(yán)重的樣品，但對于污染菌量太少的樣品，還是MPN法更有優(yōu)勢。食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀三、MPN計(jì)數(shù)法中所用的培養(yǎng)基的成分的用途說明食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯:胰蛋白胨或胰酪胨…提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求氯化鈉…………………可維持均衡的滲透壓乳糖……大腸菌群可發(fā)酵的糖類磷酸氫二鉀（K2HPO4）…………緩沖劑磷酸二氫鉀（KH2PO4）…………緩沖劑月桂基硫酸鈉…………抑制非大腸菌群細(xì)菌的生長蒸餾水……溶劑

乳糖有利于大腸菌群的生長繁殖，并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌。LST肉湯是國際上通用的培養(yǎng)基。三、MPN計(jì)數(shù)法中所用的培養(yǎng)基的成分的用途說明食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯 蛋白胨……提供碳源和氮源滿足細(xì)菌生長的需求乳糖……………大腸菌群可發(fā)酵的糖類牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液…………抑制非腸桿菌科細(xì)菌0.1%煌綠水溶液………………抑制非腸桿菌科細(xì)菌 蒸餾水………………溶劑四、平板計(jì)數(shù)法中所用的培養(yǎng)基的成分的用途說明結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA）:蛋白胨和酵母粉…提供碳氮源和微量元素乳糖…………………大腸菌群可發(fā)酵的糖類氯化鈉………………可維持均衡的滲透壓；膽鹽…………………抑制革蘭氏陽性菌，尤其是糞鏈球菌；結(jié)晶紫………………抑制革蘭氏陽性菌，pH指示劑中性紅………………pH指示劑。食品中大腸菌群檢驗(yàn)國標(biāo)的解讀

大腸菌群檢測的意義及常用方法

大腸菌群的定義、形態(tài)特征和培養(yǎng)特性一

食品中大腸菌群檢驗(yàn)的意義（以肉品為例）二

食品中大腸菌群檢測常用的方法三目錄頁

大腸菌群的定義、形態(tài)特征和培養(yǎng)特性一1.大腸菌群的定義2.大腸菌群的形態(tài)特征3.大腸菌群的培養(yǎng)特性大腸菌群的定義大腸菌群檢測的意義及常用的方法

是指一群在32～37℃下24hr內(nèi)，能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的Ⅲ亞屬細(xì)菌組成。

主要來源于人和溫血?jiǎng)游锏募S便，廣泛分布于自然環(huán)境中。

大腸菌群的形態(tài)特征大腸菌群檢測的意義及常用的方法

此菌（如下圖所示）為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。大腸菌群的培養(yǎng)特性大腸菌群檢測的意義及常用的方法

大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。在血瓊脂平板上，有些菌株產(chǎn)生β型溶血。在鑒別性或選擇性培養(yǎng)基上形成有顏色、直徑2～3mm的光滑型菌落。生化反應(yīng)：大部分菌株發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并發(fā)酵葡萄糖、麥芽胞、甘露醇、木膠糖、阿拉伯膠等產(chǎn)酸產(chǎn)氣。二、食品中大腸菌群檢驗(yàn)的意義（以肉品為例）大腸菌群檢測的意義及常用的方法1.大腸菌群在肉和肉制品中檢測的意義

大腸菌群作為糞便污染的指標(biāo)菌，來評價(jià)肉和肉制品中是否受到糞便的污染。大腸菌群計(jì)數(shù)的高低，直接反映了肉和肉制品受糞便污染的程度。大腸菌群計(jì)數(shù)的高低，可間接表示有無腸道致病菌污染的可能，進(jìn)而推斷肉和肉制品對人體健康是否具有潛在的危險(xiǎn)性。肉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，肉腐敗的原因主要是由微生物作用引起變化的結(jié)果。肉的腐敗過程是微生物將蛋白質(zhì)分解成蛋白胨、多肽、氨基酸，進(jìn)一步再分解成氨、硫化氫、酚、吲哚、糞臭素、胺及二氧化碳等的過程，這些腐敗產(chǎn)物具有濃厚的臭味，對人體健康有很大的危害。

三、食品中大腸菌群檢測常用的方法大腸菌群檢測的意義及常用的方法第一法：MPN法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。第二法：平板計(jì)數(shù)法大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的典型菌落（如右邊圖所示)挑取適量的這樣的典型菌落進(jìn)行證實(shí)實(shí)驗(yàn)，由證實(shí)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來最終確定樣品中大腸菌群的數(shù)量。三、食品中大腸菌群檢測常用的方法大腸菌群檢測的意義及常用的方法第三法：Petrifilm測試片法（快速檢測法）PetrifilmTM大腸菌群測試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和TTC指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)紅點(diǎn)周圍有氣泡的菌落為大腸菌群數(shù)。第一法：大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法

樣品的采集和處理一設(shè)備和材料二培養(yǎng)基和試劑三目錄頁

大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣程序四

大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣操作步驟五

一1.采樣原則和采樣方案2.采樣用品3.樣品的采取和送檢4.檢樣的處理

樣品的采集和處理大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法一、樣品的采集和處理1.采樣原則1.1樣品的采集應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。1.2采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染。2.采樣方案2.1根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康?、食品特點(diǎn)、批量、檢驗(yàn)方法、微生物的危害程度等確定采樣方案。2.2采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設(shè)有n、c和m值,三級采樣方案設(shè)有n、c、m和M值。一、樣品的采集和處理2.3采樣方案的解釋說明n:同一批次產(chǎn)品應(yīng)采集的樣品件數(shù);c:最大可允許超出m值的樣品數(shù);m:微生物指標(biāo)可接受水平限量值(三級采樣方案)或最高安全限量值(二級采樣方案);M:微生物指標(biāo)的最高安全限量值。注1:按照二級采樣方案設(shè)定的指標(biāo),在n個(gè)樣品中,允許有≤c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于m值。注2:按照三級采樣方案設(shè)定的指標(biāo),在n個(gè)樣品中,允許全部樣品中相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值小于或等于m值;允許有≤c個(gè)樣品其相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值在m值和M值之間;不允許有樣品相應(yīng)微生物指標(biāo)檢驗(yàn)值大于M值。大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法

一、樣品的采集和處理

例如:n=5,c=2,m=100CFU/g,M=1000CFU/g。含義是從一批產(chǎn)品中采集5個(gè)樣品,若5個(gè)樣品的檢驗(yàn)結(jié)果均小于或等于m值(≤100CFU/g),則這種情況是允許的;若≤2個(gè)樣品的結(jié)果(X)位于m值和M值之間(100CFU/g<X≤1000CFU/g)，則這種情況也是允許的;若有3個(gè)及以上樣品的檢驗(yàn)結(jié)果位于m值和M值之間,則這種情況是不允許的；若有任一樣品的檢驗(yàn)結(jié)果大于M值(>1000CFU/g)，則這種情況也是不允許的。大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法一、樣品的采集和處理2.4各類食品的采樣方案按食品安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定執(zhí)行。2.5食品安全事故中食品樣品的采集2.5.1由批量生產(chǎn)加工的食品污染導(dǎo)致的食品安全事故,食品樣品的采集和判定原則按2.3和2.4執(zhí)行。重點(diǎn)采集同批次食品樣品。2.5.2由餐飲單位或家庭烹調(diào)加工的食品導(dǎo)致的食品安全事故,重點(diǎn)采集現(xiàn)場剩余食品樣品，以滿足食品安全事故病因判定和病原確證的要求。2.采樣用品采樣箱、

滅菌采樣杯、滅菌塑料袋、有蓋搪瓷盤、滅菌刀、剪子、鑷子、滅菌帶塞廣口瓶、滅菌棉簽、溫度計(jì)、編號牌（或蠟筆和紙）大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法一、樣品的采集和處理大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法3.樣品的采取和送檢3.1生肉及臟器的檢樣如是屠宰場宰后的畜肉，可于開腔后，用無菌刀采取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各250g(或劈半后采取兩側(cè)背部最長肌肉各250g)，如是冷藏或銷售的生肉，可用無菌刀取腿肉或其他部位的肌肉250g/只（頭），檢樣采取后放入無菌容器內(nèi)，立即送檢；如果條件不許可時(shí)，最好不超過3h。送檢時(shí)應(yīng)冷藏，不得加入任何防腐劑。檢樣送往化驗(yàn)室應(yīng)立即檢驗(yàn)或放置冰箱暫存。一、樣品的采集和處理大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法3.2禽類（包括家禽和野禽）

鮮、凍家禽采取整只，放入無菌容器內(nèi)。帶毛野禽可放清潔容器內(nèi)，立即送檢。其他處理要求同3.1。3.3各類熟肉制品諸如醬鹵肉、方圓腿、熟灌腸、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般采取250g,熟禽采取整只，均放入無菌容器內(nèi)，立即送檢。其他處理同3.1。一、樣品的采集和處理大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法3.4生灌腸（臘腸、香腸）采取整根、整只，小型的可采用數(shù)根、數(shù)只，其總量不少于250g4.檢樣的處理4.1鮮肉檢樣的處理先將檢樣進(jìn)行表面消毒（在沸水內(nèi)燙3~5s，或灼燒消毒），再用無菌剪子取檢樣深層肌肉25g，放入無菌乳缽內(nèi)用滅菌剪子剪碎后，加入滅菌海砂或玻璃砂研磨，磨碎后加入滅菌水225mL，混勻后即為1:10稀釋液?；蛴镁|(zhì)器以8000~10000r/min，均質(zhì)1min，做成1:10稀釋液。一、樣品的采集和處理大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法4.2鮮、凍家禽檢樣的處理

先將檢樣進(jìn)行表面消毒，再用無菌剪子取檢樣深層肌肉25g（一般可從胸部或腿部剪?。?。其他處理同生肉。帶毛野禽去毛后，同家禽檢樣處理。4.3各類熟肉制品檢樣處理直接切取或稱取25g,其他處理同生肉。4.4臘腸、香腸等生灌腸檢樣處理先對生灌腸表面進(jìn)行消毒，用滅菌剪子剪取內(nèi)容物25g。其他處理同生肉。一、樣品的采集和處理二、設(shè)備和材料大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、

均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、天平、菌落計(jì)數(shù)器、pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙等。三、培養(yǎng)基和試劑

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、

1mol/L鹽酸（HCI)。

大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法

LST不產(chǎn)氣（－）

小導(dǎo)管里無氣泡將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯

LST產(chǎn)氣（+）四、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣程序

1.樣品的稀釋1.1固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1:10的樣品勻液。1.2液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1:10的樣品勻液。1.3樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時(shí)分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。五、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣操作步驟

1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。2.初發(fā)酵試驗(yàn)每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯)。五、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣操作步驟

接種完畢后，將其放入培養(yǎng)箱，36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。3.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中,36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計(jì)為大腸菌群陽性管。4.大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報(bào)告按3確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表(見表1),報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。五、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣操作步驟

表1大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表五、大腸菌群MPN計(jì)數(shù)檢樣操作步驟

注1：本表采用3個(gè)稀釋度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每個(gè)稀釋度接種3管。注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g（mL）、0.1g(mL)和0.01g(mL)時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增高10倍，其余類推。

大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

樣品的采集和處理一設(shè)備和材料二培養(yǎng)基和試劑三目錄頁

大腸菌群平板計(jì)數(shù)檢樣程序四

大腸菌群平板計(jì)數(shù)檢樣操作步驟五

一、樣品的采集和處理1.樣品的采樣原則和采樣方案樣品的采樣原則和采樣方案和大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法一樣，都按照國家食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則GB4789.1—2016中的相關(guān)規(guī)定去實(shí)施。2.樣品的采集和處理樣品的采集和處理方式與大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法一樣，都按照國家食品微生物學(xué)檢驗(yàn)肉與肉制品檢驗(yàn)GB/T4789.17—2003中的相關(guān)規(guī)定去實(shí)施。大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

二、設(shè)備和材料大腸菌群平板計(jì)數(shù)法除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、

均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、天平、菌落計(jì)數(shù)器、無菌培養(yǎng)皿、菌落計(jì)數(shù)器、pH計(jì)或pH比色管或精密pH試紙等。

三、培養(yǎng)基和試劑大腸菌群平板計(jì)數(shù)法

煌綠乳糖膽鹽(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉湯結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violetredbileagar,VRBA)無菌磷酸鹽緩沖液無菌生理鹽水1mol/LNaOH溶液1mol/LHCl溶液

36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h選擇15~150平板計(jì)數(shù)典型和可疑菌落挑選10個(gè)典型菌落接種到BGLB典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，直徑為0.5mm四、大腸菌群