第三章 基因工程載體課件

生命科學(xué)學(xué)院第三章基因工程載體第一節(jié)克隆載體第二節(jié)表達(dá)載體第三節(jié)其它特殊用途載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院本章重點(diǎn)掌握的內(nèi)容掌握載體、克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、α-互補(bǔ)、插入失活、人工染色體載體的概念?？寺≥d體DNA分子具備的條件。標(biāo)記基因的分類及其作用。pUC18/19質(zhì)粒載體的組成、優(yōu)點(diǎn)及質(zhì)?？寺≥d體用途。λ-DNA載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點(diǎn)。植物表達(dá)載體的組成、啟動子的類型等第三章-基因工程載體

遺傳物質(zhì)+載體

重組的DNA分子引入細(xì)胞或生物體內(nèi)復(fù)制與表達(dá)穩(wěn)定地遺傳給下代生命科學(xué)學(xué)院第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院基因工程流程圖第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院DNA：

1）獨(dú)立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個元件，一般是不可以進(jìn)入受體細(xì)胞的；

2）采用理化方法進(jìn)入細(xì)胞后，也不容易在受體細(xì)胞內(nèi)維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細(xì)胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院載體的概念載體（vector)是由在細(xì)胞中能夠自主復(fù)制的DNA分子構(gòu)成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具稱為載體。目的基因能否有效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并在其中維持高效表達(dá)，在很大程度上決定于載體。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院載體的功能載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院

載體的要求A、復(fù)制起點(diǎn)：能在受體中復(fù)制；B、篩選標(biāo)記；C、限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當(dāng)?shù)目截悢?shù)；F、載體的安全性：質(zhì)粒不能隨便轉(zhuǎn)移;G、外源基因的表達(dá)：啟動子。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322結(jié)構(gòu)圖

復(fù)制起點(diǎn)

遺傳標(biāo)記基因克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院載體的分類按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達(dá)載體用于一個基因的蛋白表達(dá)整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類

質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體人工染色體載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院載體的種類和特征質(zhì)粒*受體細(xì)胞結(jié)構(gòu)插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細(xì)胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細(xì)胞線性染色體＞

1000kb病毒載體動物細(xì)胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細(xì)胞和細(xì)菌環(huán)狀pSVK3質(zhì)粒，PBV,Ti質(zhì)粒第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第一節(jié)

克隆載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體1.質(zhì)粒的概念質(zhì)粒（plasmid)是一種存在于細(xì)菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀（線型質(zhì)粒DNA分子

—眼蟲、衣藻等）雙鏈DNA分子（酵母的“殺傷質(zhì)?！笔荝NA），可自身復(fù)制和表達(dá)。

并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

分子量在1-200kb之間。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體大腸桿菌的質(zhì)粒第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體2.質(zhì)粒的空間構(gòu)型①共價閉合環(huán)狀DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體②

開環(huán)DNA（

opencircular，

ocDNA）一條鏈上有一至數(shù)個缺口。

③

線形DNA（

linear，LDNA）第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同：

SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。

SC

OC

L

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體3.質(zhì)粒的基本特性

質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制。質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)在每個細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲?fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒（stringentplasmid）

(拷貝數(shù)少，為1-5個)和松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒（relaxed）

(拷貝數(shù)多，可達(dá)10-200個拷貝)因此，作為載體的質(zhì)粒應(yīng)該是松弛型的。質(zhì)粒

復(fù)制子

拷貝數(shù)

pBR322及其衍生質(zhì)粒

pMB115～20pUC系列質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒

突變的

pMB1500～700pSC101及其衍生質(zhì)粒pSC101～5ColE1ColE115～20第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體質(zhì)粒的不相容性(incompatibility,又稱質(zhì)粒的不親和性)

兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性。具有不相容性的質(zhì)粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復(fù)制子。

以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：

ColE1、pMB1擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

pSC101、F、RP4擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復(fù)制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性

接合型質(zhì)粒

能在天然條件下自發(fā)地從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞（接合作用）。甚至能使寄主染色體上的基因隨其一道轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體菌中。

非接合型質(zhì)粒

不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用。

值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由

mob、tra基因順式因子bom及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn)nic決定。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體TraproteinfromconjugativeplasmidbomsiteMobgenemobmRNAMobproteinopenrecipientcellhelperplasmid即mob基因的產(chǎn)物可打開非接合質(zhì)粒的oriT位點(diǎn)，借助接合質(zhì)粒tra基因的產(chǎn)物，使非接合質(zhì)粒被動遷移到受體細(xì)胞中，這種現(xiàn)象稱為遷移作用(mobilization)。質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體大腸桿菌接合（conjunction）質(zhì)粒DNA的tra基因

E.Coli產(chǎn)生菌毛宿主與受體細(xì)胞結(jié)合遺傳物在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移（指令）（遷移）第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體攜帶特殊的遺傳標(biāo)記

野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：

物質(zhì)抗性

抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物

物質(zhì)合成

抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿

這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體遺傳標(biāo)記基因

定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因標(biāo)記基因的作用

1.指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進(jìn)入宿主細(xì)胞

2.指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體標(biāo)記基因的種類

1.抗性標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2.營養(yǎng)標(biāo)記基因（可直接用于選擇轉(zhuǎn)化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，

這類基因在酵母轉(zhuǎn)化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3.生化標(biāo)記基因

其表達(dá)產(chǎn)物可催化某些易檢測的生化反應(yīng)，如lacZ，GUS，CAT4.噬菌斑第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體抗藥性標(biāo)記選擇(插入失活法)

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因

β-半乳糖苷酶基因（lacZα和lacZβ）

β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個部分可獨(dú)立存在，分別由兩個基因編碼。為α鏈編碼的基因稱之為lacZα(編碼145AAs)。這兩個基因（LacZα和LacZβ）均可作為標(biāo)記基因。

β-半乳糖苷酶基因的優(yōu)點(diǎn):a.

酶催化X-Gal水解為蘭色產(chǎn)物，檢測直觀

b.lacZα編碼5'-端可容許很大的變化而不影響酶活性

c.lacZα和β鏈基因的分別表達(dá)可使載體小而容量大

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體

PLacZαLacZβ

轉(zhuǎn)錄

翻譯

αβ

常用的遺傳標(biāo)記基因

LacZ基因的結(jié)構(gòu)與產(chǎn)物第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體lacZ

β-半乳糖苷酶分解半乳糖i

P

O

調(diào)控蛋白P

大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體lacZ-β-半乳糖苷酶-分解半乳糖i

P

O

調(diào)控蛋白P

α-肽段分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑IPTGa-互補(bǔ)顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）β-半乳糖苷酶基因lacZ突變體M15第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體X-galX-gal

-peptideC-terminusofb-galactosiase

+第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體互補(bǔ)顯色反應(yīng)

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體α-互補(bǔ)(α-complementation)

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體常用的遺傳標(biāo)記基因

葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標(biāo)記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點(diǎn)外，它的適用范圍十分廣泛，因?yàn)樵S多生物中沒有這種基因。

熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產(chǎn)生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產(chǎn)生熒光，若在反應(yīng)中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯(lián)用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

發(fā)光蛋白質(zhì)基因

發(fā)光蛋白是由水母產(chǎn)生的一種可發(fā)光的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可使大腸桿菌菌落呈藍(lán)色。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體4.質(zhì)粒的命名原則人工組建的質(zhì)粒

人工組建的質(zhì)粒的第一個字母是質(zhì)粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質(zhì)粒的作者和實(shí)驗(yàn)室名稱，再其后為質(zhì)粒的編號。如pBR322，字母p代表質(zhì)粒，BR是構(gòu)建該質(zhì)粒的研究人員的姓名，322代表…構(gòu)建的一系質(zhì)粒的編號。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體5.質(zhì)粒載體的發(fā)展概況

第一階段（1977年前）天然質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的利用，如pSC101,ColE1,pCR,pBR313和pBR322。

第二階段增大載體容量（降低載體長度），建立多克隆位點(diǎn)區(qū)和新的遺傳標(biāo)記基因。如pUC系列載體。

第三階段完善載體功能以滿足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列載體，含T3，T7，sp6啟動子載體，表達(dá)型載體及各種探針型載體。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體6.質(zhì)粒載體構(gòu)建

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：

pSC1018.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因Tcr

ColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1

RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Ampr第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體

第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒,克隆位點(diǎn)少，Tetr

作為篩選標(biāo)志。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院A、刪除不必要的DNA區(qū)域:

盡量縮小質(zhì)粒的分子量，以提高外源DNA片段的裝載量。B、減少限制性酶切點(diǎn):

缺失突變，限制性酶、核酸外切酶和連接酶的共同作用，機(jī)械破碎和質(zhì)粒之間的重組等方法。C、加入易于識別的選擇標(biāo)記：通過質(zhì)粒之間的重組，可以使質(zhì)粒帶有合適的選擇性標(biāo)記。D、安全性能改造：質(zhì)粒載體不能在細(xì)菌之間隨便轉(zhuǎn)移。E、改造或加入基因表達(dá)的調(diào)控序列：啟動子。質(zhì)粒的改造第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體7.質(zhì)粒載體的分類

人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：

高拷貝質(zhì)粒

突變拷貝數(shù)控制基因

拷貝數(shù)1000-3000

擴(kuò)增基因

低拷貝質(zhì)粒

來自pSC101拷貝數(shù)小于10表達(dá)某些毒性基因

溫敏質(zhì)粒

在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)

測序質(zhì)粒

含有測序通用引物互補(bǔ)序列和多酶接頭polylinker

整合質(zhì)粒

裝有整合促進(jìn)基因及位點(diǎn)

便于外源基因的整合

穿梭質(zhì)粒

裝有針對兩種不同受體的復(fù)制子

便于基因克隆

表達(dá)質(zhì)粒

裝有強(qiáng)化外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件

探針質(zhì)粒

裝有報告基因

便于啟動子等元件的克隆篩選第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體8.常用質(zhì)粒載體（1）pBR322復(fù)制起點(diǎn)

ori：pMB1系列（來源于ColE1）高拷貝型復(fù)制起點(diǎn)Ampr基因：pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因Tetr基因：pSC101的Tetr

基因。長度：4363bp選擇標(biāo)記：氨芐青霉素和四環(huán)素抗性?？寺∥稽c(diǎn)：含有多個克隆位點(diǎn)。

Ampr基因內(nèi)可被PstI，PvuI，SacI切開，而Tetr基因可被BamHI，HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。第三章-基因工程載體pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體pBR322:4.3KbApr/TcrPstI/BamHI、SalI/HindIII、EcoRI生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院普通型載體pBR322的結(jié)構(gòu)圖第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體AmprTetrTetrAmpsPstI....

....涂布有Tet的培養(yǎng)基涂布有Amp的培養(yǎng)基......重組體的篩選.外源基因的插入：第三章-基因工程載體

BamHI片段(Tcr)

pBR322PstI(Apr)片段重組分子Ⅱ(ApsTcr)

PstI片段

外源DNABamHI片段重組分子I

涂布Ap平板分別轉(zhuǎn)化E.coli(ApSTcS)重組分子Ⅱ

涂布Tc平板影印到Tc平板上AprTcr為原載體即為非重組子影印到Ap平板上利用抗生素抗性基因篩選重組子的過程重組分子I

(AprTcs）AprTcS為重組子ApSTcr為重組子Tcr轉(zhuǎn)化子Apr轉(zhuǎn)化子生命科學(xué)學(xué)院第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選重組克隆的“插入失活”篩選方法

pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets

、Ampr——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上可生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長；

pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培養(yǎng)基上不生長，在含有四環(huán)素培養(yǎng)基可生長；而在兩種抗生素培養(yǎng)基上都生長的是非重組型。這種在一個基因位點(diǎn)中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現(xiàn)象叫插入失活。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體pBR322重組克隆的篩選第三章-基因工程載體pBR322質(zhì)粒載體優(yōu)點(diǎn)：

第一，具有較小的分子量——4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。第三，具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增之后，每個細(xì)胞中可累積1000～3000個拷貝。生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體（2）pUC系列質(zhì)粒載體在pBR322的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體，其組成如下：含有pBR322完整的Ampr基因和復(fù)制起始點(diǎn)。含有大腸桿菌

-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼

-肽鏈的DNA序列，即lacZ’基因。在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS區(qū)段，但并不破壞該基因的功能。

pUC18、pUC19第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體

pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)：具有較小的相對分子質(zhì)量和更高的拷貝數(shù)，平均每個細(xì)胞可達(dá)500-700個拷貝。適用于組織化學(xué)方法檢測重組體，有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的

-肽鏈可參與

-互補(bǔ)作用，在IPTG誘導(dǎo)和底物X-gal存在下，形成藍(lán)色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體（3）穿梭質(zhì)粒載體(shuttlevector)：這種質(zhì)粒分子上含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質(zhì)粒等。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒載體TA克隆載體(補(bǔ)充)

用Taq酶的PCR產(chǎn)物3’端加上了一個A。根據(jù)這一特點(diǎn)研制出一種線性質(zhì)粒，其5’端突出的T，它們之間可以連接，即TA克隆。

再生TA克隆載體的方法：①克隆載體的線性化②克隆載體末端補(bǔ)平③克隆載體末端加T第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、

質(zhì)粒載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體

噬菌體（Bacteriophage）它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA(線性)，結(jié)構(gòu)上有一個蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體

噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋?/p>

1.高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞；

2.自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學(xué)特性

λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體；λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成；λDNA在噬菌體中是線狀DNA分子，全長

48.502kb雙鏈DNA，60多個基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據(jù)

。

cos位點(diǎn)（cohesiveendsite):在DNA兩端各有12nt的5`單鏈突出(5‘-GGGCGGCGACCT-3’)，彼此序列互補(bǔ)。它是包裝時的切割信號。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學(xué)特性λ噬菌體的生活周期第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體

λ噬菌體：雙鏈DNA溫和噬菌體

DNA大小約為50kb粘性末端：12bp的互補(bǔ)單鏈

當(dāng)λ噬菌體進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)后,其粘性末端能通過堿基互補(bǔ)作用,形成環(huán)狀DNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn),它是包裝蛋白的識別位點(diǎn),λ噬菌體的包裝與DNA特性和其它序列無關(guān),但對包裝的DNA大小有要求,包裝范圍大約在36kb-51kb。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體λ噬菌體作為構(gòu)建載體材料的依據(jù)：

λ噬菌體是一種溫和噬菌體；能承載比較大的外源DNA片段；在λ噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點(diǎn)，便于多種DNA酶切片段的克隆。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(二)構(gòu)建λ噬菌體的基本原理

(1)λ噬菌體的缺陷：

基因組太大（48.5kb）；

酶切點(diǎn)太多，它有5個BamH1位點(diǎn)（G↓GATCC），6個BgⅠ位點(diǎn)（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點(diǎn)（G↓AATTC）。

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當(dāng)于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納48.5kb×5%=2.425kb的DNA。

重組的λDNA分子難于直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞—利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(三)構(gòu)建λ噬菌體的基本內(nèi)容

構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略：

切去部分非必須的區(qū)域；抹去多余的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)；插入可供選擇的標(biāo)記基因；建立體外包裝系統(tǒng)。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體選擇標(biāo)記

(1)加裝選擇標(biāo)記imm434imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的λ-載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體選擇標(biāo)記

(2)加裝選擇標(biāo)記lacZLacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體λ-DNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)

大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體（1）插入型載體

載體長度37kb插入位點(diǎn)體外包裝插入片段大?。?-14kb（51–37）插入片段體外包裝第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體λgt10載體

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（2）替換型載體

在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。這是由于構(gòu)建此載體時，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列，因此，當(dāng)外源DNA插入時，一對克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。如：

λEMBL3第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體插入型載體替換型載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(五)常用的λ噬菌體載體

（一）

β－半乳糖苷失活插入型載體（二）

免疫功能失活插入型載體（三）

Charon系列取代型載體（四）λEMBL系列取代型載體（五）Spi-正選擇取代型載體（六）

λZAP插入型載體

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(六)Lambda噬菌體載體的克隆原理及步驟

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體(七)λ-DNA重組分子的體外包裝

λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過體外包裝，然后將重組DNA通過噬菌體導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。

這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少E組份，另一部分則缺少D組份。包裝時，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組λ-DNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組λ-DNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計的。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體D基因缺失的λ噬菌體突變株（D-）E基因缺失的λ噬菌體突變株（E-）EproteinDprotein重組λDNA（裂解物）（裂解物）infectassembleBHB2688-E-的溶原菌BHB2690-D-的溶原菌λ噬菌體的體外包裝系統(tǒng)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體λ-DNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)

λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡便λ-DNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體M13、f1、fd都為絲狀單鏈DNA噬菌體。優(yōu)越性：單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的

DNA簡稱RFDNA；2.不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多制約的，不存在包裝限制問題；4.容易測定外源DNA片斷的插入取向；5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體

M13噬菌體載體

M13是一種含單鏈（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。

這類載體主要用來獲得大量的單鏈DNA片段，主要用來測定DNA序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體

M13噬菌體的特點(diǎn)

感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會形成雙鏈的復(fù)制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）?？梢韵筚|(zhì)粒DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。

無論是RFDNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。

噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的，這一點(diǎn)正好與λ噬菌體相反，所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問題。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體M13噬菌體產(chǎn)生單雙鏈DNA的機(jī)制

1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補(bǔ)（－）鏈，該雙鏈稱復(fù)制型DNA（RFDNA）。

2、RFDNA在宿主細(xì)胞內(nèi)能快速增殖，可增加到每個細(xì)胞約200個拷貝。

3、單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補(bǔ)鏈，即（－）鏈的合成，這樣，細(xì)胞就會不斷的合成（+）鏈DNA。

4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主細(xì)胞膜，同時基因V的蛋白質(zhì)從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體插入一段lacDNA片段，即帶有

-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列及其N端頭146個aa編碼信息，宿主F’因子攜帶缺失第11-41位氨基酸的lacZ’M13mp載體系列第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:裝載量大，能排斥空載體，轉(zhuǎn)染效率高,操作較難，

DNA不穩(wěn)定。單純以質(zhì)粒為基礎(chǔ)構(gòu)建的載體:有天然的抗性選擇標(biāo)記，操作容易（易于分離和轉(zhuǎn)化），較穩(wěn)定,裝載量小，轉(zhuǎn)化效率較低；第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體(一)黏粒載體

也稱柯斯質(zhì)粒載體、粘粒。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體的基本特點(diǎn)

具有λ噬菌體的特性(體外包裝，高效感染等)；具有質(zhì)粒載體的特性(易于克隆操作、選擇及高拷貝等)；具有較高容量（45kb）的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。

不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體的構(gòu)建第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體應(yīng)用黏粒作載體進(jìn)行基因克隆的一般程序第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體黏粒載體的克隆原理及步驟

1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同

3．體外包裝：在

的A蛋白的功能作用下切割cos位點(diǎn)并將其中的DNA包裝到成熟的

噬菌體顆粒中去

4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細(xì)胞并通過cos位點(diǎn)的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體常用黏粒載體結(jié)構(gòu)圖

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體缺點(diǎn)：A、多個Cosmid分子重組，降低陽性率；B、多個DNA分子同時插入，失真。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體(二)噬菌粒載體

由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。

它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體常用的噬菌粒載體pUC118和pUC119

1.具有較小分子量的共價、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；

2.編碼一個ampr基因作為選擇記號，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；

3.拷貝數(shù)含量高，每個寄主可高達(dá)500個；

4.存在著一個多克隆位點(diǎn)區(qū)；

5.可按照IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子；第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體6.插入的外源基因以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；7.含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子；8.帶有一個M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；9.在pUC118和pUC119這兩個載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA；10.可以直接對克隆的DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體pBluescript噬菌粒載體

基本結(jié)構(gòu)：

1.在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對T3和T7噬菌體的啟動子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動；

2.同時具有一個單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個來自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；

3.編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子記號；

4.含有l(wèi)acZ基因，可用Xgal-IPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體用于體外轉(zhuǎn)錄pBluescript噬菌粒載體T7T3第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院三、噬菌體-質(zhì)粒雜合載體常用噬菌粒載體的一般特征第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，

此時考斯質(zhì)粒(45kb)和噬菌粒載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。

將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，

它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。

或稱為自主復(fù)制序列(ARS)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用

人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復(fù)制元件來驅(qū)動外源DNA片段復(fù)制的載體。

實(shí)際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點(diǎn)、端粒和復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，以及合適的選擇標(biāo)記基因。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點(diǎn)是能容納長達(dá)1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用

(一)酵母人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。

YAC具有自主復(fù)制序列、克隆位點(diǎn)以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。可以接受350-400kb的外源DNA片段。

四膜蟲的端粒序列

酵母染色體的復(fù)制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統(tǒng)的選擇標(biāo)記

大腸桿菌的復(fù)制子

大腸桿菌的選擇標(biāo)記第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用pYAC3第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用

用pYAC3進(jìn)行克隆策略如下：

載體用BamHI和SnaBI雙酶切，形成3個片段。

移去BamHI之間的片段，留下另外兩段，每一段的兩端都分別是TEL序列和SnaBI位點(diǎn)。

被克隆的DNA，兩端必須切成平末端(SnaBI是一個平末端內(nèi)切酶，識別TACGTA序列)。

把三者連接起來，形成了人工染色體。

用原生質(zhì)轉(zhuǎn)化的方法把人工染色體轉(zhuǎn)入釀酒酵母。用作宿主的菌株是雙營養(yǎng)缺陷型Trp1-ura3-

，可以被人工染色體上的篩選標(biāo)記基因恢復(fù)成Trp1+ura3+

。

在基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，只有含有結(jié)構(gòu)正確的人工染色體的轉(zhuǎn)化體可以生存。

如果染色體構(gòu)建錯誤，如在被克隆的DNA兩側(cè)連接了相同的兩段載體DNA片段，則因缺少一種篩選標(biāo)記，使得轉(zhuǎn)化體不能在基本成分培養(yǎng)基上存活。

外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判斷，即可以很簡單地由菌落的顏色看出：紅色的菌落是重組體，而白色的菌落則不是。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用(二)細(xì)菌人工染色體

細(xì)菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。

pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)

構(gòu)建動植物基因文庫

缺點(diǎn)：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆DNA部分的缺失或重排。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院四、人工染色體及其應(yīng)用(三)P1派生人工染色體

結(jié)合了

P1載體和

BAC載體的最佳特性，包括陽性選擇標(biāo)記

sacB及噬菌體

P1的質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子。

(四)哺乳動物人工染色體

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院

第二節(jié)

表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復(fù)制子即可；表達(dá)載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的一類載體。這類載體既有復(fù)制子，更要有強(qiáng)啟動子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細(xì)胞中復(fù)制，也可在真核細(xì)胞中擴(kuò)增和表達(dá)。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體表達(dá)載體構(gòu)建的一般原則

1.閱讀框架與外源基因高效表達(dá)

2.啟動子與外源基因高效表達(dá)

3.轉(zhuǎn)錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達(dá)

4.有效的翻譯起始與外源基因高效表達(dá)

5.終止密碼子選擇與外源基因高效表達(dá)

6.外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達(dá)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，載體必須具備的條件：⑴載體能夠獨(dú)立復(fù)制，具有復(fù)制起點(diǎn)。⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體啟動子：影響表達(dá)效率的主要因素之一是啟動子的強(qiáng)弱。常見啟動子見下表。啟動子的強(qiáng)弱取決于啟動子本身的序列，尤其是—10和—35區(qū)的堿基組成及彼此的間隔長度，同時也與啟動子和外源基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)間的距離有很大關(guān)系。復(fù)制子：一段包含復(fù)制起始位點(diǎn)的DNA片段。

Ecoli.質(zhì)粒常見的有pMB1、ColE1等。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT啟動子第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體

最佳啟動子具備的條件：

第一必須是強(qiáng)啟動子第二啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平第三啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的（熱或化學(xué)誘導(dǎo)）第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性

外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)。終止子

強(qiáng)終止子的選擇與使用

目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體

外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）核糖體結(jié)合位點(diǎn)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)包括下列四個特征結(jié)構(gòu)要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子

大腸桿菌絕大部分基因以

AUG作為閱讀框架的起始位點(diǎn)，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。構(gòu)建Ecoli.表達(dá)載體時要考慮所表達(dá)基因的種類和性質(zhì)，或?qū)ν庠椿虻膲A基進(jìn)行適當(dāng)置換，或?qū)寺≥d體上的調(diào)控序列進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體類型:

Ⅰ型：轉(zhuǎn)錄起始區(qū)（調(diào)控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)終止子

+翻譯起始區(qū)（核糖體結(jié)合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉(zhuǎn)錄起始區(qū)

+翻譯起始區(qū)

+信號肽鏈編碼區(qū)

+終止子（常稱之為表達(dá)分泌型載體）第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院第二節(jié)

表達(dá)載體

三種表達(dá)型載體結(jié)構(gòu)圖第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(一)原核表達(dá)載體

適用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體

1.原核表達(dá)載體的表達(dá)元件

啟動子

轉(zhuǎn)錄終止子

核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）

表達(dá)方式：

組成型表達(dá)

誘導(dǎo)型表達(dá)

融合型表達(dá)

分泌型表達(dá)

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體

融合型表達(dá)載體

PSDForeignDNA融合型表達(dá)載體融合基因(一)原核表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體Ptac：IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白—直接純化產(chǎn)物切割方便：

pGEX-1

T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體

融合型表達(dá)載體

(一)原核表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(一)原核表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導(dǎo)蛋白跨膜2、優(yōu)點(diǎn)：分泌表達(dá)，避免降解。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體

(二)酵母表達(dá)載體

原核生物和真核生物存在翻譯后修飾反應(yīng)機(jī)制的差異，

真核基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中難以獲得有活性的蛋白。

酵母是真核表達(dá)的首選系統(tǒng)

酵母表達(dá)載體是一種穿梭表達(dá)載體：既能在大腸桿菌中繁殖，又能在酵母中復(fù)制、表達(dá)和選擇。

第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體

(二)酵母表達(dá)載體DNA復(fù)制起始區(qū)（含兩類復(fù)制起始序列）選擇標(biāo)記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標(biāo)記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達(dá)盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等)第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體

(二)酵母表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(二)酵母表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

1.天然Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與及其致瘤功能

Ti質(zhì)粒（tumorinducingplasmid)是根癌農(nóng)桿菌中可引發(fā)植物產(chǎn)生瘤狀物的質(zhì)粒，是環(huán)狀雙鏈DNA。

根據(jù)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的冠癭堿的不同可分為：

章魚堿型（octopine）胭脂堿型（nopaline）農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）[或稱琥珀堿型（succinamopine）]

其實(shí)這些Ti質(zhì)粒合成不同的冠癭堿外，在基因結(jié)構(gòu)上也有一定的差異第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體TiPlasmid：

已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

1.天然Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與及其致瘤功能

毒性區(qū)（vir區(qū)）：激活T-DNA的轉(zhuǎn)移

T-DNA區(qū)：侵染植物時，從Ti質(zhì)粒上被切割，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，帶有與腫瘤形成有關(guān)的基因接合轉(zhuǎn)移區(qū)（Con區(qū)）：存在與細(xì)菌間進(jìn)行接合有關(guān)的基因復(fù)制起始區(qū)（Ori區(qū)）：

保證Ti質(zhì)粒進(jìn)行自我復(fù)制第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

2.Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

利用T-DNA可攜帶DNA片段并整合到植物基因組的特性，對天然Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造，用于植物轉(zhuǎn)基因載體。

一元表達(dá)載體

雙元表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

2.Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

一元表達(dá)載體【也稱為共整合載體（cointegratevectors）系統(tǒng)】

需要同源重組才能插入外源基因。

pGV3850是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

2.Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

一元表達(dá)載體外源基因插入pGV3850的過程第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體第三章-基因工程載體生命科學(xué)學(xué)院一、質(zhì)粒表達(dá)載體(三)Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

2.Ti質(zhì)粒表達(dá)載體

雙元表達(dá)載體：由兩個分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質(zhì)粒構(gòu)