(1.4.1.8)-生化實(shí)驗(yàn)十三 Km值測(cè)定

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目十三

Km值測(cè)定教學(xué)目的： 一、掌握Km值的定義和意義，掌握可調(diào)式移液器的使用方法。

二、熟悉林-貝氏雙倒數(shù)法測(cè)定Km及Vmax值的過(guò)程。

三、了解實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的思路，優(yōu)缺點(diǎn)。

原理： 當(dāng)溫度、pH等條件恒定時(shí)，酶促反應(yīng)速度V隨底物濃度[S]增大而增大，二者關(guān)系符合米氏方程。

V=

Vmax[S]

Km+[S]原理：

Km的值相當(dāng)于酶促反應(yīng)為最大速度一半時(shí)的底物濃度。是酶的特征性常數(shù)。用米氏方程作圖求Km不方便，將方程雙側(cè)取倒數(shù)，即得到直線方程（林-貝氏作圖法）。

1Km11

VVmax[S]Vmax=.+原理：1V1S1Km1Vmax原理： 酵母蔗糖酶Km的測(cè)定：

蔗糖酶分解蔗糖為葡萄糖和果糖，分解產(chǎn)物與堿性銅鹽共熱，在堿性條件下，Cu2+被還原為Cu2O，Cu2O再還原砷鉬酸試劑生成鉬藍(lán)，鉬藍(lán)顏色的深淺與生成還原性糖的量成正比，通過(guò)比色分析，可求得酶促反應(yīng)速度。原理：

Cu2+————Cu2O

Mo+6————

Mo+5----+2(藍(lán)色)葡萄糖和果糖還原操作步驟

取13支試管，編號(hào)：12345678910111213緩沖溶液0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--蔗糖-0.10.20.30.40.50.10.20.30.40.5--水0.60.50.40.30.20.10.50.40.30.20.11.00.8堿性銅鹽1.01.01.01.01.01.01.0混勻各管，30度保溫5min后，1~6管間隔準(zhǔn)確1分鐘加保溫的酶液酶0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2--1號(hào)管30度保溫10分鐘后，加堿性銅鹽終止反應(yīng)，間隔準(zhǔn)確1分鐘終止1~6管標(biāo)準(zhǔn)葡糖------------0.2操作步驟

將13支試管同置沸水浴中加熱20分鐘后，冷卻，每管加砷鉬酸試劑1mL，搖勻后，放置5分鐘，各加蒸餾水7mL，用塑料膜壓住管口，顛倒混勻，660nm比色分析：

以1號(hào)管為酶空白測(cè)定2-11號(hào)管吸光度

以12號(hào)管為水空白測(cè)定13號(hào)管吸光度計(jì)算一、計(jì)算各管反應(yīng)中所產(chǎn)生的還原糖的微量摩爾數(shù)。

二、按林-貝氏作圖法以各管的實(shí)際蔗糖濃度的倒數(shù)作橫坐標(biāo)即1/[S]，以各管每分鐘產(chǎn)生的還原糖的微摩爾數(shù)的倒數(shù)為縱坐標(biāo)即1/V，繪制直線

三、求出Km及Vmax結(jié)果（供參考）

2：0.122

3：0.244

4：0.335

5：0.475

6：0.658

7：0.008

8：0.016

9：0.024

10：0.089

11：0.189

13：0.250

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

結(jié)果（供參考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2號(hào)管：[S]=0.01M

3號(hào)管：[S]=0.02M

4號(hào)管：[S]=0.03M

5號(hào)管：[S]=0.04M

6號(hào)管：[S]=0.05M

結(jié)果（供參考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2號(hào)管：1/[S]=100L/mol

3號(hào)管：1/[S]=50L/mol

4號(hào)管：1/[S]=33.3L/mol

5號(hào)管：1/[S]=25L/mol

6號(hào)管：1/[S]=20L/mol

以此值為橫坐標(biāo)結(jié)果（供參考）

2-7：0.114

3-8：0.228

4-9：0.311

5-10：0.386

6-11：0.469

13：0.250

2號(hào)管：V=0.114/0.250*1*400*0.1

=18.24μmol/min.mL

3號(hào)管：V=36.48μmol/min.mL

4號(hào)管：V=49.76μmol/min.mL

5號(hào)管：V=61.76μmol/min.mL

6號(hào)管：V=70.54μmol/min.mL

以此值倒數(shù)為縱坐標(biāo)結(jié)果（供參考）

2號(hào)管：1/V=0.054825

3號(hào)管：1/V=0.027412

4號(hào)管：1/V=0.020096

5號(hào)管：1/V=0.016192

6號(hào)管：1/V=0.013326

min.mL/μmol

以此值為縱坐標(biāo)2號(hào)管：1/[S]=100L/mol

3號(hào)管：