HYT 0295-2020 海綿種屬分子鑒定技術(shù)規(guī)程

中華人民共和國(guó)海洋行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)海綿種屬分子鑒定技術(shù)規(guī)程2020-06-28發(fā)布中華人民共和國(guó)自然資源部發(fā)布I本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)自然資源部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：大連海洋大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所、大連金普新區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村發(fā)展服務(wù)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：付晚濤、曹旭鵬、杜萌萌、蘇延明、王剛、吳孟嘉、張世杰、李東子、沈思思、1海綿種屬分子鑒定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海綿種屬分子生物學(xué)鑒定的原理與方法、海綿樣品采集與保存。本標(biāo)準(zhǔn)適用于海綿的樣品采集、保存和分子生物學(xué)方法種屬鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T12763.6—2007海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物資源調(diào)查GB/T30744—2014深海微生物樣品前處理技術(shù)規(guī)范HY/T058—2010海洋調(diào)查觀測(cè)監(jiān)測(cè)檔案業(yè)務(wù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。目前已知仍然生存的最古老、最低等的多細(xì)胞動(dòng)物，在動(dòng)物界中單獨(dú)構(gòu)成多孔動(dòng)物門。DNA條形碼DNAbarcode生物體內(nèi)能夠代表該物種的、標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段，用于快速準(zhǔn)確識(shí)別、鑒定物種。海綿條形碼spongebarcode海綿的保守基因序列信息的一種表述形式。編碼18SrRNA基因的DNA序列。細(xì)胞色素氧化酶亞基IcytochromeoxidasesubunitI編碼線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(CytochromeoxidasesubunitI)基因的DNA序列。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreactionDNA模板先經(jīng)高溫變性為單鏈，在適宜溫度下和緩沖液中，兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火，接著在DNA聚合酶催化下以四種dNTP為底物，使退火引物得以延伸，如此反復(fù)變性、退火和延伸，使位于兩段引物序列之間的DNA片段呈幾何倍數(shù)擴(kuò)增。2通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(簡(jiǎn)稱PCR)分別擴(kuò)增海綿的18SrDNA和COIDNA的部分序列，測(cè)序獲得各自序列信息后分別與已經(jīng)鑒定的海綿18SrDNA和COIDNA序列比對(duì)，以此鑒定海綿種屬。5儀器與設(shè)備5.1野外生物樣品保存箱或保溫箱。5.2低溫冰箱。5.5水浴鍋。5.6高速低溫冷凍離心機(jī)。5.7紫外分光光度計(jì)。5.8聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA擴(kuò)增儀(簡(jiǎn)稱PCR儀)。5.9電泳儀。5.10高壓滅菌鍋。5.11酒精燈。5.12液氮罐。6試劑與材料6.1無水乙醇。6.270%乙醇。6.3液氮。6.4異丙醇。6.5濃硝酸或濃鹽酸。6.6濃硫酸。6.7蒸餾水或去離子水。6.8蛋白酶K。6.10瓊脂糖。6.11醋酸鉀溶液(配方見附錄A)。6.12細(xì)胞裂解緩沖液(配方見附錄A)。6.13TE緩沖液(pH7.6)(配方見附錄A)。6.1410×PCR緩沖液(配方見附錄A)。6.15吸管。6.16載玻片。6.17采樣袋或采樣瓶。6.18聚丙烯離心管。37海綿樣品采集與保存7.1海綿樣品采集首先，對(duì)于海綿及其周圍環(huán)境，先拍照或攝像；此外，按照GB/T12763.6—200加入無水乙醇與海綿樣品的體積比為(4～5):1,然后放入裝有冰袋的泡沫保溫箱或野外生物樣品保存箱。有條件時(shí)，直接放入冰箱冷藏保存。保存時(shí)間1天。暫時(shí)保存在無水乙醇中1天海綿樣品，需要更換全部無水乙醇。然后冷凍保存1周。暫時(shí)保存在無水乙醇中1天海綿樣品或采集海綿樣品需要轉(zhuǎn)移至一20℃保存。在一20℃保存約2周時(shí)間，需要更換全部無水乙醇，乙醇加入量與海綿樣品的體積比同樣為(4～5):1,然后可繼續(xù)放在一20℃保存。在一20℃繼續(xù)保存約3個(gè)月，需要更換全部無水乙醇，然后繼續(xù)放在一20℃保存。由此，在一20℃條件，可以按此方法連續(xù)保存1年。海綿樣品采集與保存記錄于《海綿資源調(diào)查采樣表》(詳見附錄B)。8海綿種屬分子生物學(xué)鑒定方法8.1.1取出保存在乙醇中的海綿樣品，在樣品幾何中心部位取樣品約0.5g,放入事先用液氮預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨海綿樣品成粉末狀。8.1.2將上述研磨成粉末的海綿樣品量約1/5移入裝有600μL細(xì)胞裂解緩沖液的聚丙烯離心管中混8.1.3從水浴鍋取下裝有海綿的離心管，在室溫加入200μL醋酸鉀溶液，振蕩、混勻。8.1.4將步驟8.1.3的離心管在4℃、10000g離心力條件下離心3min,然后將上清液轉(zhuǎn)移至裝有8.1.5將步驟8.1.4的離心管在室溫、10000g離心力條件下離心3min,然后吸去上清液，加入600μL乙醇(70%),振蕩、混勻。8.1.6將步驟8.1.5的離心管在室溫、10000g離心力條件下離心3min,棄上清液。8.1.8將步驟8.1.7離心管中的上清液吸去，將離心管中DNA風(fēng)干15min。8.1.9將步驟8.1.8中DNA沉淀溶解于300μLTE緩沖液(pH7.6),作為海綿基因組DNA提取液，8.1.10按照GB/T30744—2014中9.2.1規(guī)定，將步驟8.1.9收獲的DNA進(jìn)行純度測(cè)定，滿足要求的DNA用于PCR擴(kuò)增。48.2海綿18SDNA序列片段PCR擴(kuò)增與測(cè)序8.2.1使用擴(kuò)增海綿18SrDNA基因序列片段的特異引物對(duì)(18SrRNA-F:TTGACGGAAGGGCACCA;18SrRNA-R:CAAAGGGCAGGGACGTAATC),在100μLPCR反應(yīng)管中，以海綿基因組DNA提取液為模板，以18SrRNA-F/18SrRNA-R為引物，按照Taq酶產(chǎn)品說明書推薦的優(yōu)化體系配制50μLPCR反應(yīng)液。8.2.2把此PCR反應(yīng)管放在PCR儀中，按照如下條件在進(jìn)行PCR擴(kuò)增海綿18SrDNA基因序列片段：首先，94℃變性3min;接著，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，擴(kuò)增的溫度條件為94℃變性20s;55℃退火30s;72℃停留1min;最后，72℃停留5min,結(jié)束PCR反應(yīng)。8.2.3從PCR儀中取出擴(kuò)增的海綿基因片段產(chǎn)品，按照GB/T30744—2014中9.2.2規(guī)定使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格，然后測(cè)序獲得待鑒定海綿18SrDNA片段序列信息。8.3海綿COIDNA序列片段PCR擴(kuò)增與測(cè)序8.3.1使用擴(kuò)增海綿COI基因的序列片段的特異引物對(duì)(LCO1490:GGTCAACAAATCATA應(yīng)管中，以海綿基因組DNA提取純化液為模板，以LCO1490(20pmol/L)/HCO2189為引物，按照Taq酶產(chǎn)品說明書推薦的優(yōu)化體系配制50μLPCR反應(yīng)液。8.3.2把此PCR反應(yīng)管放在PCR儀中，按照如下條件在進(jìn)行PCR擴(kuò)增海綿COI基因序列片段：首先，94℃、變性5min;接著，1個(gè)預(yù)循環(huán)反應(yīng)(94℃、30s,45℃、90s,72℃、1min)重復(fù)5次；然后，1個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94℃、30s,51℃、40s,72℃、1min)重復(fù)35次；最后，72℃停留5min,結(jié)束PCR反應(yīng)。8.3.3從PCR儀中取出擴(kuò)增的海綿基因片段擴(kuò)增產(chǎn)品，經(jīng)電泳檢測(cè)合格，然后測(cè)序獲得待鑒定海綿COIDNA片段序列信息。8.4海綿分子生物學(xué)種屬鑒定8.4.1參照GB/T30744—2014附錄C中C.3規(guī)定，通過互聯(lián)網(wǎng)搜索、比對(duì)、鑒定微生物菌屬方法，將測(cè)序獲得的海綿18SrDNA片段序列信息和COIDNA片段序列信息在在線網(wǎng)站(/)分別進(jìn)行18SrDNA和COIDNA的核苷酸序列比對(duì)，結(jié)果記錄于海綿分子生物學(xué)鑒定記錄與結(jié)果判定表(見附錄C)。8.4.2根據(jù)國(guó)際公認(rèn)的基于海綿COIDNA片段序列信息鑒定海綿種屬在線網(wǎng)站(http://www.palaeontologie.geo.uni-muenchen.de/SBP/)進(jìn)行海綿COI基因的核苷酸序列比對(duì)，結(jié)果記錄于海綿分子生物學(xué)鑒定記錄與結(jié)果判定表(見附錄C)。8.4.3以海綿18SrDNA和COIDNA的片段序列信息鑒定海綿的判斷依據(jù)和結(jié)果，記錄于《海綿分子生物學(xué)鑒定記錄表》(見附錄C)。8.4.4數(shù)據(jù)資料處理記錄應(yīng)按HY/T058—2010要求歸檔。5(規(guī)范性附錄)各溶液和緩沖液的配方各溶液和緩沖液的配方見表A.1。表A.1各溶液和緩沖液的配方60mL5mol/L醋酸鉀，11.5mL冰醋酸10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1100mmol/LTris-HCl(10×PCR緩沖液1.05kg/cm2高壓滅菌6(規(guī)范性附錄)海綿資源調(diào)查采樣表采樣工具