熒光定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化

熒光定量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化PCR的建立與優(yōu)化核酸純化與逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑體系引物、探針的設(shè)計(jì)第2頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天3長(zhǎng)度 16-24bases（引物）序列 不能有以下情況：任意2個(gè)引物或探針之間的序列互補(bǔ)引物或探針本身有二級(jí)結(jié)構(gòu)連續(xù)的>GGG，引物的5’端有G引物3’端最后5個(gè)堿基有2個(gè)以上的G或C引物3’端最后1個(gè)堿基為AGC含量 40-60%GC

GC/AT分布大致均衡,C含量>G探針復(fù)性溫度 65－70°C引物復(fù)性溫度60－65°CPCR引物與探針第3頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天標(biāo)記

淬滅基團(tuán)采用無(wú)熒光背景的如BHQ,不要用tamraPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度 50－150bpDesign primerdesignsoftware，選擇序列保守區(qū)域如果保守區(qū)域太短，可以在引物中考慮引入LNA提高Tm

探針可以考慮引入LNA或改用MGB或自淬滅taqman探針簡(jiǎn)并引物或探針需要同時(shí)考慮多種情況下的Tm高低純化與否 PAGE/HPLC

PCR引物與探針第4頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天SNP的Taqman雙色檢測(cè)中，突變探針一般Fam標(biāo)記相對(duì)定量分析中內(nèi)參基因一般Hex標(biāo)記(例如Roche的UPL相對(duì)定量解決方案)

對(duì)檢測(cè)要求更高的建議Fam標(biāo)記(靈敏度或者定量vs定性)

擴(kuò)增效率較差的建議Fam標(biāo)記

PCR引物與探針第5頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天ReactionConditions

PrimersandProbesConcentrationRange(finalcon.)Primers: 0.1μM–1.0μMeachProbes: 0.1μM–0.5μMStandardConcentrations(finalconc.)Primers: 0.5μMeachProbes: 0.2μMExample:UniversalProbeLibraryassayHigherprimers/probeconcentrationsgivebettersignaltonoiseratio(higherfluorescencesignalintensitiy)OnlyminorinfluenceonCpwhenusedinmediumconcentrationranges第6頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR的建立與優(yōu)化核酸純化與逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑體系引物、探針的設(shè)計(jì)第7頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天建立新的PCR體系:

GeneralHints模板 -DNA或cDNA為模板對(duì)照-NTC(notemplatecontrol)每個(gè)探針引物組合 -陽(yáng)性對(duì)照(如果可能)分析 -擴(kuò)增:sensitivityandefficiencyofPCR(crossingpoints)-熔解曲線分析(SYBRGreenIformat):檢測(cè)引物二聚體或其它非特異性擴(kuò)增凝膠電泳:驗(yàn)證非特異性擴(kuò)增meltingcurve(雜交探針等模式):突變檢測(cè)或亞型分析第8頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天StandardConditionsinPCRMgCl2Concentration:2-5mM第9頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天BasicOptimizationinPCRUseanytemplatenucleicacid(NA)suitableforPCR,sufficientlypurifiedandfreeofPCRinhibitorsTemplateConcentration: 建議測(cè)試多個(gè)稀釋度

(最少2個(gè)梯度,10^2)genomicDNA 50ng-5pgplasmidDNA approx.106copies

RNA ≤500ngtotalRNAor100ngmRNAcDNA ≤50ngequivalentoftotalRNA，RTproductundiluted,1:10and1:100dilutionsNAStorageStorenucleicacidsinhighconcentrationsandaliquotsForlowtemplateconcentrations,usesiliconizedtubesandadd

carrierNA(10ng/μl),e.g.MS2RNA第10頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天BasicOptimization:

MgCl2Titration

MgCl2Titration:2-5mMFormat:SYBRGreenILCFastStartDNAMaster第11頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天BasicOptimization:

TemplateConcentration

模板濃度過(guò)高會(huì)抑制PCR

TemplateDNA

undilutedand1:10dilutionFormatSYBRGreenILIghtCycler?DNAMasterNTCsample1originalsample11:10sample2originalsample21:10第12頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天SYBRGreenIFormat

PCRAnalysisExample

模板拷貝數(shù)越低，越容易出現(xiàn)引物二聚體QuantificationMeltingCurveAnalysis第13頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天Optimization:

InfluenceofPCRInhibitors

PCR抑制物可通過(guò)適當(dāng)稀釋樣品降低對(duì)其對(duì)PCR的影響NTCcDNAoriginalcDNA1:2cDNA1:4cDNA1:20TemplatecDNA

undiluted,1:2,1:4,1:20dilutionsFormatSYBRGreenILightCycler?DNAMaster第14頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天FurtherOptimizationinPCR檢測(cè)靈敏度和信號(hào)強(qiáng)度可以通過(guò)調(diào)整下列參數(shù)得以改進(jìn)第15頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天PCR的建立與優(yōu)化核酸純化與逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑體系引物、探針的設(shè)計(jì)第16頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細(xì)胞1050.5-1μg人白細(xì)胞105細(xì)胞中RNA的種類和含量第17頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天“chaotropicsalts”inbindingbufferRoche手工提取RNA的試劑盒細(xì)胞和組織HighPureRNAIsolationKitHighPureRNATissueKitTriPureIsolationReagent甲醛固定石蠟包埋組織和石蠟包埋組織HighPureFFPERNAMicroKitHighPureRNAParaffinKit提取mRNAmRNAIsolationKitmRNACaptureKitHighPuremiRNAIsolationKit病毒RNAHighPureViralRNAKit*HighPureViralNucleicAcidKit第18頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA操作注意事項(xiàng)RNA酶（Rnase）是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)。此酶非常穩(wěn)定，在一些極端的條件下只可暫時(shí)失活，但限制因素去除后又迅速恢復(fù)活性。常規(guī)高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。1.Rnase廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時(shí)必須戴手套2.

Rnase可存在于取液器中，因此設(shè)置RNA專用pipettor,或者采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內(nèi)部和外部，可基本達(dá)到要求。3.塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

a.盡量已標(biāo)明RNase-free的塑料制品，如沒(méi)有開(kāi)封使用過(guò)，通常不必處理，

處理步驟：在浸泡塑料制品的容器中，加入終濃度為0.05%~0.1%的DEPC-H2O，室溫放置過(guò)夜，第二天將DEPC-H2O倒出，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。b.玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時(shí)以上或者180℃烘烤8小時(shí)以上第19頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA操作注意事項(xiàng)

選擇新鮮血液，不得超過(guò)4小時(shí)

選擇新鮮、生長(zhǎng)旺盛的組織

選擇處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的細(xì)胞可將新鮮血液先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，得到白細(xì)胞，然后加入一定量的細(xì)胞裂解液/TRNzol，-70℃保存較長(zhǎng)時(shí)間

推薦使用專門的RNA樣品儲(chǔ)存液進(jìn)行儲(chǔ)存

去掉培養(yǎng)基，加入一定量RNA提取試劑，-70℃保存較長(zhǎng)時(shí)間RNA應(yīng)分裝后凍存于-70冰箱，樣品不能反復(fù)凍融長(zhǎng)期保持：RNA提取步驟進(jìn)行到在70%乙醇洗滌時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)，讓RNA保存于70%乙醇中第20頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天RNA的評(píng)價(jià)與鑒定純度（OD260/OD280

）：OD260/OD280<1.9說(shuō)明有蛋白污染OD260/OD280＝1.9～2.1說(shuō)明純度很好OD260/OD280>2.1說(shuō)明有部分降解得率（OD260）Yield＝OD260×稀釋倍數(shù)×40ng/ul紫外分光光度計(jì)檢測(cè)第21頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天1％瓊脂糖，6V/cm，15min，上樣1～3ul

電泳檢測(cè)M12M12DNA殘留蛋白殘留RNA的評(píng)價(jià)與鑒定第22頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天RT反應(yīng)主要組成成分ReverseTranscriptase

AMVReverseTranscriptase(AvianMyeloblastosisVirus)48–55°C

M-MuLVReverseTranscriptase(MoloneyMurineLeukaemia)37–42°CTranscriptorReverseTranscriptase(recombinant,E.coli.)upto65°C引物（OligodTorRandomPrimersorGeneSpecificPrimers)Sequence-specificprimersRandomHexamerPrimersandanchoredoligo(dT)NRNA模板第23頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天TranscriptorReverseTranscriptaseTranscriptorreversetranscriptaseAbilitytosynthesizefragmentsupto14kb(fulllengthcDNA)Reversetranscriptionofdifficulttemplates(e.g.,GC-richRNAtemplates)duetothermostabilityupto65°CRNaseHactivity:degradesRNAinRNA:DNAhybridTranscriptorRTInvitrogenSuperscriptIIInvitrogenSuperscriptIIIMaxProductsize14kb12.3kb12.3kbReactiontime30mins50mins30-60minReactiontemperature42-65℃42℃50-55℃Sensitivity50pgtotalRNA1ngtotalRNA10pgRNAGC-richtemplateYESNoinfoNoinfoRNaseHactivityYESReducedReduced第24頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天一步法RT-PCR

VS.二步法RT-PCR2-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationseparately1-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationinonereaction

everythingforreversetranscriptioneverythingforPCR108copiesofthesequenceofinteresteverythingforreversetranscriptionNewlysynthesizedcDNAcDNAtogetherwitheverythingforPCR108copiesofthesequenceofinterest第25頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天一步法和二步法RT-PCR優(yōu)點(diǎn)比較一步法RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)二步法RT-PCR的優(yōu)點(diǎn)降低污染的風(fēng)險(xiǎn)SingletubeReactionNotransfer/openingrequiredAutomationispossible可以分別優(yōu)化RT和PCR反應(yīng)條件Efficientandaccurateamplification增加了靈敏度和特異性Sequence-specificprimersEntirecDNAsampleaspCRtemplate更加靈活A(yù)llowschoiceofprimerscDNAfromasingleRTcanbeusedinseveralPCRsWidechoiceofRTandPCRenzymes減少反應(yīng)時(shí)間FewerpipettingstepsReducedtotaltimeofRT-PCR可以最大擴(kuò)增到14kbAmplifyRNAsequencesupto14kb第26頁(yè),共29頁(yè)，2024年2月25日，星期天TranscriptorHiFicDNASynthesisKitFeaturesBlendofTranscriptorenzymeandaproofreadingproteinAchieve7-foldhigherfidelitycomparedtonormalreversetranscriptasesObtainfull-lengthcDNAsynthesisinonly10minDetectaslowas10pgtemplateRNAApplicationsSequencingtranscriptomesQuantitativeRT-PCRapplicationsRNAsplicinganalysisCloninggenesofinterestGeneratingcDNAlibrari