《寵物疫病與公共衛(wèi)生》實(shí)訓(xùn)17課件講解

鳥新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)實(shí)訓(xùn)目標(biāo)本實(shí)驗(yàn)以新城疫為例作為鳥類病毒性疾病診斷技術(shù)的代表，要求比較系統(tǒng)地了解新城疫的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)，以達(dá)到觸類旁通的目的；掌握新城疫的免疫監(jiān)測技術(shù)。主要儀器設(shè)備與場地1.設(shè)備材料：被檢病料、新城疫被檢血清、新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原，、新城疫陽性血清(HI效價(jià)為1:640)、9～10日齡雞胚、生理鹽水、阿氏液、青霉素、鏈霉素、75%酒精棉球、5%碘酊棉球、孵化器(或電熱恒溫箱)、照蛋器、錐子、蛋架、玻璃注射器(1ML、5ML或10ML)、刻度吸管(0.5ML、1ML、5ML、10ML)、手術(shù)剪刀、眼科剪刀、眼科鑷、組織鑷、試管架、研缽、電動(dòng)離心機(jī)、微型振蕩器、微量加樣器、96孔V型反應(yīng)板、1%雞紅細(xì)胞懸液、ф2～3mm塑料管（一次性輸液管）、記號(hào)筆、酒精燈、培養(yǎng)箱。2.場地：傳染病實(shí)驗(yàn)室。病料的采取和處理材料應(yīng)采自早期病例，病程較長的不適宜于分離病毒。病鳥撲殺后無菌采取脾、腦和肺組織；生前可采取呼吸道分泌物。將材料制成1:5～1:10的乳劑，并且加入青霉素、鏈霉素各1000IU/ML，以抑制可能污染的細(xì)菌，置4℃冰箱2～4hr后離心，取其上清液作為接種材料。同時(shí)，應(yīng)對(duì)接種材料做無菌檢查。取接種材料少許接種于肉湯、血瓊脂斜面及厭氧肝湯各一管，置37℃培養(yǎng)觀察2～6d，應(yīng)無細(xì)菌生長。如有細(xì)菌生長，應(yīng)將原始材料再做除菌處理，如有可能最好再次取材料。病毒的分離培養(yǎng)常用9～11日齡的非免疫雞胚，劃出氣室，在接近氣室的絨毛尿囊膜而無大血管處作一標(biāo)記，用碘酒消毒，并在此點(diǎn)錐一小孔，再在氣室端鉆一小孔，供排氣用（圖10-4a）。將針頭與蛋殼成30度角刺入注射孔3～5mm，注入上述處理過的材料0.1～0.2ML于尿囊腔內(nèi)。亦可在氣室部距氣室邊緣0.3～0.5cm處的蛋殼上穿一小孔，針頭垂直刺入約1～1.5cm（估計(jì)已透過絨毛尿囊膜），即可注入接種材料（圖10-4b）。接種后用石蠟封口，氣室向上，繼續(xù)置35～37℃孵化箱中孵育，每天照蛋1～2次，繼續(xù)觀察4～7d。病毒鑒定對(duì)血凝試驗(yàn)呈陽性的樣品采用新城疫陽性血清進(jìn)一步進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。如果沒有血凝活性或血凝效價(jià)很低，則采用初代分離的尿囊液繼續(xù)經(jīng)雞胚傳兩代，若仍為陰性，則認(rèn)為新城疫病毒分離陰性。被檢血清的制備刺破鳥翅靜脈，用塑料管引流吸取血液至塑料管長度的2/3處（長3～5cm），然后將塑料管的一端在酒精燈上熔化封口。在管上貼膠布注明鳥號(hào)，待血液凝固后，經(jīng)1500r/min離心5min，取血清備用。在免疫鳥群中定期隨機(jī)取樣，抽樣率保證有代表性，每群一般采16份以上血樣。鳥群小的采樣比例為3%～10%，大的為0.1%～0.3%。原則上，小鳥群（100只以上）的采樣不能少于10只，大鳥群（萬只以下）不少于50～100只，萬只以上的大鳥群，可按0.1%～0.5%的比例采樣。1%雞紅細(xì)胞懸液制備經(jīng)翅靜脈或心臟采集2～3只健康公雞（最好未經(jīng)新城疫免疫或接種時(shí)間較長）血液與阿氏液混合后，置刻度離心管中用1500rpm離心8min，棄上清，沉淀物再用生理鹽水混勻，經(jīng)離心洗滌3次，最后根據(jù)離心壓積的紅細(xì)胞量，用生理鹽水配制成1%紅細(xì)胞懸液。血凝試驗(yàn)首先在96孔V型反應(yīng)板1～12孔各加生理鹽水50uL。再用微量移液器取50uL被檢抗原于第1孔，吹吸3次（或用稀釋棒）混勻后，吸50uL至第2孔，依次做倍比稀釋至第11孔，再從第11孔吸取50uL棄去，第12孔不加抗原作對(duì)照。然后換一個(gè)吸頭，依次在各孔加入1%紅細(xì)胞各50uL。最后在微型振蕩器上振蕩1min，在20～30℃靜置20min，每5min觀察1次，觀察1hr，以血凝圖象判定結(jié)果血凝抑制試驗(yàn)首先在1～12孔各加入生理鹽水50μL。用微量移液器吸50μL被檢血清于第1孔內(nèi)，吹吸4次混勻后，吸50μL至第2孔，依次做倍比稀釋至第11孔，再從第11孔吸取50μL棄去。然后換一個(gè)吸頭向1～12孔各加入50μL4個(gè)血凝單位病毒液，