組培苗培養(yǎng)與管理（植物組織培養(yǎng)課件）

組培苗培養(yǎng)與管理組培苗的培養(yǎng)組培苗馴化與移栽【知識點】組培易發(fā)問題的原因與調(diào)控措施組培苗培養(yǎng)條件，組培苗的特點，組培苗馴化方法【技能點】能解決組培易發(fā)問題，培養(yǎng)健壯組培苗會進(jìn)行組培苗移栽養(yǎng)護(hù)素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無菌意識、創(chuàng)新意識、團(tuán)隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實事求是的工作態(tài)度。組培苗的培養(yǎng)一、組培苗培養(yǎng)1、培養(yǎng)程序1）初代培養(yǎng)指在組培過程中，最初建立的外植體無菌培養(yǎng)階段，即無菌接種完成后，外植體在適宜的光、溫、氣等條件下被誘導(dǎo)成無菌短枝（或稱莖梢）、不定芽（叢生芽）、胚狀體或原球莖的過程。也稱為誘導(dǎo)培養(yǎng)。

由于外植體來源復(fù)雜，又?jǐn)y帶較多的雜菌，初代培養(yǎng)一般是比較困難的，是植物組培成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。2）繼代培養(yǎng)將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織、芽、苗、胚狀體或原球莖等重新分割，接種到新配制的培養(yǎng)基上，進(jìn)一步增殖擴(kuò)繁的培養(yǎng)過程稱為繼代培養(yǎng)，也稱增殖培養(yǎng)。

通過初代培養(yǎng)多獲得的不定芽、無菌短枝、胚狀體或原球莖等無菌材料被稱為中間繁殖體。中間繁殖體可以按幾何系數(shù)擴(kuò)繁。例如：2株苗為基礎(chǔ)，每棵苗的繁殖系數(shù)為3（即一株苗剪成3段接種，培養(yǎng)一段時間后每段又形成3株苗），那么經(jīng)過10代繁殖，將生成多少株苗？2×310=1180963）壯苗與生根壯苗培養(yǎng)生根培養(yǎng)：NAA和IBA是最常用于誘導(dǎo)生根的生長素，使用濃度一般為0.1-10.0mg/L。2、組培苗培養(yǎng)條件1）溫度：培養(yǎng)室內(nèi)的溫度通常是控制在25±2℃。2）光照：植物所需的光照強(qiáng)度為1000-5000lx，培養(yǎng)室每日光照10-16h。3）濕度：容器內(nèi)的濕度?？杀３衷?00%，培養(yǎng)室的相對濕度一般應(yīng)保持在70%--80%之間。4）通氣：在固體培養(yǎng)中，不要把培養(yǎng)物全部埋入培養(yǎng)基內(nèi)，以避免氧氣不足。

培養(yǎng)室要適當(dāng)通風(fēng)換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況，每次通風(fēng)后要進(jìn)行一次消毒，避免引起培養(yǎng)物污染。1.試管苗培養(yǎng)條件。2.培養(yǎng)程序。小結(jié)?。?？二、組培污染的原因及防治組培常見問題1、培養(yǎng)基污染來源與防治（1）培養(yǎng)基污染可能的來源培養(yǎng)容器操作器械接種室的環(huán)境操作者本人培養(yǎng)室的環(huán)境外植體培養(yǎng)基本身污染的病原分為細(xì)菌和真菌兩大類（2）細(xì)菌污染原因分析材料帶菌培養(yǎng)基滅菌不徹底操作人員的不慎使用了未經(jīng)充分滅菌的工具（鑷子、培養(yǎng)皿等）手接觸材料或器皿邊緣，使微生物落入材料或器皿防治：1、接種前，洗手，用70%酒精棉球擦拭雙手；戴口罩，不說話，防止呼吸時呼出的細(xì)菌所引起；每接一瓶材料后用酒精擦手指。防治：2、提高外植體滅菌技術(shù)，選取帶菌少的材料，微生物少的季節(jié)和時間。3、每個培養(yǎng)周期不宜過長。4、培養(yǎng)瓶容器的封口類型。防治：5、接種用的工具每接一瓶至少要灼燒滅菌一次。6、凡是污染材料，均要高壓蒸汽滅菌，或用70%酒精殺菌，降低污染源。（2）真菌污染原因分析接種室的空氣本身不潔凈、灰塵很多超凈工作臺的過濾裝置失效培養(yǎng)用器皿的口徑過大操作不慎等原因引起防治：1、無菌室內(nèi)安裝空氣循環(huán)過濾裝置，通過紫外線照射滅菌。2、超凈工作臺提前開機(jī)20min以達(dá)到空氣的充分過濾滅菌。3、接種，用70%酒精棉球擦拭雙手，戴口罩，不聊天；每接一瓶后用酒精擦手指。4、接種時要嚴(yán)格操作，接種工具要燒紅，不碰觸任何物品，打開瓶蓋時動作要輕及去掉瓶塞后瓶子應(yīng)拿成斜角等。5、培養(yǎng)瓶容器的封口類型。6、每個培養(yǎng)周期不宜過長。7、凡是污染材料先高原蒸汽滅菌，或用70%酒精殺菌，降低污染源。8、培養(yǎng)室安裝凈化設(shè)備，并勤開紫外燈滅菌，以及酒精噴霧和冰醋酸熏蒸滅菌。

提問針對操作流程：外植體取材——預(yù)處理——消毒——接種——組培苗培養(yǎng)與管理，分析每個步驟引起的污染源2、培養(yǎng)常見問題及對策1）污染所謂污染是指在組織培養(yǎng)過程中，有細(xì)菌、真菌等微生物的侵染，在培養(yǎng)基的表面滋生大量菌斑，造成培養(yǎng)材料不能生長和發(fā)育的現(xiàn)象。（1）污染識別若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染。若從培養(yǎng)基以下開始長菌，發(fā)生時間較早，且有從里向外的趨勢，則說明是切口引起的污染。若是外植體帶菌，菌類從材料的培養(yǎng)基以上部位長起，且發(fā)生在5天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。（2）來源材料表面消毒不徹底，植物材料帶入培養(yǎng)過程。植物內(nèi)生菌隨材料帶入培養(yǎng)過程。無菌操作過程中外界環(huán)境進(jìn)入培養(yǎng)容器造成。（3）種類細(xì)菌性污染：培養(yǎng)基某一位置或培養(yǎng)材料周圍出現(xiàn)黏液狀或渾濁的水漬狀痕，有時呈現(xiàn)發(fā)酵狀泡沫。接種后1-2天可見。真菌性污染：培養(yǎng)基污染部位發(fā)霉，顏色黝黑、白、黃等。接種后3-5天或更長時間出現(xiàn)。（4）污染的防止選擇合適的植物材料：幼嫩材料、溫室材料、清潔材料、草本材料、中午陽光最強(qiáng)時的材料帶菌少。嚴(yán)格滅菌：對難滅菌材料采用多次滅菌法，對材料內(nèi)部的細(xì)菌，可在培養(yǎng)基中添加抗生素來解決。污染的防止合理安排繁殖程序：將獲得的無菌培養(yǎng)物一部分保存起來，分批繁殖和復(fù)檢后再提供給大規(guī)模生產(chǎn)。操作規(guī)范：培養(yǎng)室要求清潔、密閉、接種室要經(jīng)常用紫外線照射、冰乙酸熏蒸、70%酒精噴霧殺菌等。2）褐變褐變（又稱褐化）是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變褐，培養(yǎng)材料也隨之變褐，甚至死亡的現(xiàn)象。（1）成因切割外植體時，體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成棕褐色的醌類物質(zhì)，當(dāng)擴(kuò)散到培養(yǎng)基后，會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。（2）影響褐變的因素基因型：褐變和品種有關(guān)，在多酚氧化酶活性上的差異，對不同的品種分別進(jìn)行處理。生理狀態(tài)：褐變程度的輕重常與取樣外植體組織的生理狀態(tài)有關(guān)；處于幼齡期的植物材料或幼嫩的組織褐變程度不明顯，而從成年的植株或老熟的組織采收的外植體，含醌類物質(zhì)較多，容易褐變。培養(yǎng)基成分：無機(jī)鹽濃度過高，會使某些觀賞植物的褐變程度增加；細(xì)胞分裂素的水平過高會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。外植體大小：材料太小，在培養(yǎng)過程中容易褐變。外植體組織的受傷程度：在取材料時，應(yīng)盡量減少傷口面積，創(chuàng)傷面要盡量平整。影響褐變的因素培養(yǎng)材料的繼代時間：培養(yǎng)過程中，如果推遲繼代時間，會導(dǎo)致材料的褐變，最終材料全部死亡。滅菌的化學(xué)藥品：楊樹葉片作外植體，用70%乙醇時間處理過長，容易褐變。溫度和光照：光照國強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，加速培養(yǎng)物的褐變程度。(3)克服外植體褐變的方法適合外植體和培養(yǎng)條件：選擇生長處于旺盛的外植體，可使褐變現(xiàn)象明顯減輕。無機(jī)鹽成分，植物生長物質(zhì)水平，適宜溫度均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。連續(xù)轉(zhuǎn)移（繼代培養(yǎng)）：對容易褐變的材料可連續(xù)繼代培養(yǎng)，減輕醌類物質(zhì)對外植體的毒害。加入抗氧化劑：使用半胱氨酸，抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。3）試管苗玻璃化當(dāng)植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化（也稱為超水化現(xiàn)象）。發(fā)生玻璃化的試管苗稱為玻璃化苗。（1）特點形態(tài)解剖學(xué)特點：整株矮小腫脹、失綠；葉片皺縮成縱向卷曲、脆弱易碎；葉表缺少角質(zhì)層蠟質(zhì)，沒有功能性氣孔，不具柵欄組織，僅有海綿組織。生理生化特點：玻璃化苗體內(nèi)含水量與可溶性糖含量高，但干物質(zhì)、葉綠素、蛋白質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素含量低。(2)玻璃苗的危害呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細(xì)胞持水力差，植株蒸騰作用強(qiáng)，無法進(jìn)行正常移栽。玻璃廟生長緩慢、繁殖系數(shù)下降，如果再在相同的培養(yǎng)基上和相同的培養(yǎng)條件下進(jìn)行繼代培養(yǎng)后死亡。玻璃苗生根困難。（3）控制和克服玻璃化的措施使用固體培養(yǎng)基：增加瓊脂濃度，降低培養(yǎng)基水勢，造成細(xì)胞吸水阻遏；提高瓊脂純度，也可降低玻璃化。適當(dāng)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和赤霉素的濃度。提高光照強(qiáng)度，玻璃苗放于自然光下幾天后莖、葉變紅，玻璃化逐漸消失，因自然光中的紫外線能促進(jìn)試管苗成熟，加快木質(zhì)化。使用透氣性好的封口材料，改善氧氣的供應(yīng)狀況，降低培養(yǎng)容器內(nèi)部環(huán)境的相機(jī)濕度。（3）控制和克服玻璃化的措施培養(yǎng)基中加入間苯三酚或根皮苷、青霉素鉀、活性炭、聚乙烯醇（PVA）均可有效抑制玻璃苗的發(fā)生。青霉素G鉀（2-6mg/L）能有效防治菊花試管苗的玻璃化。改變供氮形態(tài)，降低銨態(tài)氮濃度，提高硝態(tài)氮含量，及時轉(zhuǎn)移，減少氨積累。提高培養(yǎng)基中無機(jī)鹽含量，增加培養(yǎng)基中\(zhòng)Ga\Mg\Mn\K\P\Fe\Gu元素含量，降低N和Cl元素比例。5、其他問題：還有黃化、變異、瘦弱或徒長、不生根或生根率低、移栽成活率低、材料死亡、增殖率低或過盛等問題。1.什么是褐變？2.什么是污染？3.什么是試管苗玻璃化？習(xí)題組培苗培養(yǎng)與管理組培苗的培養(yǎng)組培苗馴化與移栽【知識點】掌握組培苗馴化與移栽方法

【技能點】能馴化管理移栽苗素質(zhì)要求：培養(yǎng)學(xué)生無菌意識、創(chuàng)新意識、團(tuán)隊合作意識和生態(tài)環(huán)保意識；具有任務(wù)執(zhí)行力，規(guī)范操作、注意安全；科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實事求是的工作態(tài)度。

組培苗馴化與移栽一、組培苗馴化1.組培苗的特點①組培苗生長細(xì)弱，莖、葉表面角質(zhì)層不發(fā)達(dá)；②組培苗莖、葉雖呈綠色，但葉綠素的光合作用較差；③組培苗的葉片氣孔數(shù)目少，活性差；④組培苗根的吸收功能弱。異養(yǎng)狀態(tài)，自身光合能力很弱，依靠培養(yǎng)基為其生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。苗的類型生境光照溫度相對濕度養(yǎng)分氣體菌態(tài)組培苗弱，易調(diào)控適宜且穩(wěn)定高豐富光下CO2低，有害氣體量高無菌實生苗強(qiáng)，波動大波動性大較低，波度大較貧瘠各種氣體成分較穩(wěn)定有菌2.組培苗與實生苗的區(qū)別3.組培苗與實生苗在形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能上的差異苗的類型葉片及其功能根系及其功能組培苗角質(zhì)層薄，水孔多，氣孔的生理活性差，保水能力差；此外葉綠體的光合性能也差根系不發(fā)達(dá)，吸水能力差實生苗角質(zhì)層較厚，水孔少，氣孔的生理活性強(qiáng)；葉綠體的光合性能好根系發(fā)達(dá)，吸水能力強(qiáng)4.組培苗馴化1）馴化目的：是人為創(chuàng)造一種由組培苗生境逐漸向自然環(huán)境過渡的條件，促進(jìn)組培苗在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理方面向正常苗轉(zhuǎn)化，使之更能適應(yīng)外界環(huán)境，從而提高組培苗移栽的成活率。2）馴化原則：應(yīng)從光、溫、氣、濕及有無雜菌等環(huán)境要素考慮。3）馴化方法：將裝有組培苗的培養(yǎng)容器移到溫室或大棚，先不要打開瓶蓋或封口膜，并不能立即接受太陽光的直接照射，以免瓶內(nèi)升溫太快，使幼苗因蒸騰作用過強(qiáng)失水萎蔫，甚至死亡?？梢韵冗M(jìn)行適當(dāng)遮蔽，再逐漸撤除保護(hù)，讓組培苗接受自然散射光照射，并逐步適應(yīng)自然的晝夜溫差變化。3-5d后打開瓶蓋或封口膜，使培養(yǎng)瓶中甚至更接近外界環(huán)境條件，再煉苗2-3d后即可移栽。組培苗馴化成功的標(biāo)準(zhǔn)是莖長粗、葉增綠、根系延長并由白色變?yōu)辄S褐色。馴化要求：1）濕度鍛煉：使小苗逐步適應(yīng)周圍環(huán)境的濕度。移栽前開瓶蓋進(jìn)行濕度鍛煉。2）基質(zhì)疏松：珍珠巖、蛭石、西沙，營養(yǎng)土、腐殖土等。3）調(diào)控光、溫、濕等因子：生長季閉口煉苗期間調(diào)控光照強(qiáng)度、防雨水影響。部分遮光條件下移栽后管理，保持合適溫度。4）將小苗進(jìn)行分級苗高和根數(shù)是評估移栽苗的重要指標(biāo)。5.試管苗的生根1）試管內(nèi)生根5.試管苗的生根2）試管外生根甘薯5.試管苗的生根3）無根苗的嫁接二、組培苗移栽1.基質(zhì)準(zhǔn)備移栽基質(zhì)要求疏松、透水、通氣，有一定的保水性，易消毒處理，不利于雜菌滋生。常選用的基質(zhì)有蛭石、珍珠巖、河沙、草炭土、腐殖土、爐灰渣、谷殼、鋸木屑等。

常用的有珍珠巖：蛭石：草炭土為1:1:0.5，或河沙：草炭土為1:1。2.移栽方法1）常規(guī)移栽將馴化后的小苗取出，用清水洗去附著于根部的瓊脂培養(yǎng)基，操作時應(yīng)盡量減少對根系和葉片的損傷。用50%多菌靈800倍溶液浸泡消毒1-2min，然后移栽到混合基質(zhì)中。（農(nóng)藥稀釋倍數(shù)是指稀釋用的水是農(nóng)藥的重量（固體）或體積（液體）倍數(shù)。）

移栽深度適宜，可埋沒葉片。移栽后要澆一次透水，保持一定的溫度和水分，適當(dāng)遮陰。當(dāng)長出2-3片新葉時，即可將其移栽到田間或盆缽中。2）直接移栽直接將組培苗移栽到盆缽中。這種方法適合具有專業(yè)化生產(chǎn)的溫室條件，選用適宜的盆栽基質(zhì)，直接將生根組培苗移栽入盆，隨著植株的生長，再逐漸換大型號的花盆。3）嫁接有些木本植物不易在瓶內(nèi)生根，可選取合適的實體幼苗作砧木，用組培苗作接穗進(jìn)行嫁接。嫁接移栽法與常規(guī)移栽法相比具有移栽成活率高、適用范圍廣、成苗所需的時間短、有利于移栽植物的生長發(fā)育等許多優(yōu)點。移苗注意：苗盤消毒：用0.1%的高錳酸鉀對苗盤進(jìn)行浸泡消毒或噴淋消毒。基質(zhì)消毒：對已用過的需用0.1%高錳酸鉀噴淋后用自來水沖洗干凈。移栽技術(shù)：當(dāng)根系打到一定長度（小于1cm）時移栽，帶瓊脂少，傷根輕，移栽時應(yīng)將小苗基部的培養(yǎng)基沖洗干凈，切忌傷根和莖葉。如根長，可剪為2-3cm。移栽后根迅速固著于土壤基質(zhì)并吸收營養(yǎng)。3.注意事項常用的有珍珠巖：蛭石：草炭土為1:1:0.5，或河沙：草炭土為1:1。

苗盤移栽：將消毒后的蛭石或珍珠巖放在苗盤內(nèi)，厚度約4-6cm，用水淋透后，將洗凈的組培苗栽植在培養(yǎng)基質(zhì)內(nèi)，用水噴淋透后放置在拱棚內(nèi)保護(hù)培養(yǎng)2-3周。保持溫度和濕度。營養(yǎng)缽移栽：營養(yǎng)缽與營養(yǎng)土的準(zhǔn)備：營養(yǎng)土最好采用腐殖土與細(xì)沙（或蛭石）按照3：1的比例混合過篩后備用。將組培苗從苗盤提出，栽植在營養(yǎng)缽中，澆一次透